Казахстанські ветеринари зробили власний RT-PCR тест на блютанг: 80% чутливості, 98% специфічності
У Казахстані розробили й перевірили на 61 польовій пробі власну тест-систему Real-Time RT-PCR для виявлення вірусу блютангу. Діагностична чутливість 80%, специфічність 98,14%, точність 95,31%. Аналітична межа — 3 пг плазмідної ДНК. Перехресних реакцій з іншими вірусами немає.
Блютанг за останні десятиліття суттєво розширив ареал — Європа, Азія, обидві Америки, Австралія й Нова Зеландія. Причина — зміна клімату й розширення habitatів Culicoides. Для Казахстану з його щільною популяцією дрібної рогатої худоби це прямий ризик швидкого поширення інфекції при заносі вірусу.
Серологія тут погано працює: ELISA в ендемічних зонах не відрізняє активну інфекцію від пост-вакцинального чи пост-інфекційного імунітету. Тому молекулярні методи, зокрема real-time RT-PCR, — основний інструмент ранньої діагностики, у тому числі безсимптомних випадків.
Що зробили. Розробили тест-систему Real-Time RT-PCR-Blutanque-RIBSP в Інституті проблем біобезпеки (Казахстан). Мішень — ген VP7 (сегмент S10), найконсервативніша ділянка геному серед серотипів BTV. Дизайн праймерів і зондів — Primer Express 3.0.1, Oligo Analyzer, Primer-BLAST; зонд TaqMan з 5′-FAM і 3′-BHQ1. З чотирьох наборів праймер-зонд найкращу ефективність ампліфікації дав BTV10S/1 — стабільний і відтворюваний результат.
Умови реакції. Зворотна транскрипція 50 °C 30 хв, початкова денатурація 95 °C 15 хв, далі 45 циклів: 95 °C 15 с і 55 °C 30 с, флуоресценція зчитується на етапі відпалу/елонгації. Склад суміші: MMLV ревертаза 8,5 Од/мкл, Taq-полімераза 0,4 Од/мкл, dNTP 0,8 мМ, MgSO₄ 10 мМ. Позитивний контроль — плазміда pGEM-T-BTV (3140 п.н.), негативний — вода без нуклеаз. Поріг позитивності: Ct < 38; Ct ≥ 38 або відсутність ампліфікації — негативно.
Аналітичні характеристики. Межа виявлення — 3 пг плазмідної ДНК (серійні 10-кратні розведення фрагмента 121 п.н.). Специфічність перевіряли на панелі гетерологічних вірусів: сказ, чума дрібних жуйних, чума м'ясоїдних, хвороба Ауєскі, лейкоз ВРХ, інфекційний бронхіт курей. Перехресних реакцій немає.
Клінічна валідація. 61 польова проба з ВРХ (n=40) і дрібних жуйних (n=21) із шести регіонів Казахстану (Жетису, Алмати, Туркестан, Жамбил, Павлодар, Північний Казахстан). Порівняння з комерційним референс-набором PCR-Bluetongue-Factor (Росія). Результат: діагностична чутливість 80%, специфічність 98,14%, загальна точність 95,31%.
Для практики. Тест дає раннє виявлення BTV у польових умовах і підходить для епідеміологічного нагляду та контролю переміщення тварин. Обмеження — чутливість 80% означає, що частину позитивних проб тест пропускає; негативний результат у підозрілого пацієнта варто перевіряти повторно або іншим методом.