Овечий ABCD4: клонували cDNA, зробили рекомбінантний білок і антитіла

ABCD4 — напівтранспортер родини ABC, який працює на мембрані лізосом і виводить кобаламін (вітамін B12) з лізосом у цитоплазму. У людини втрата функції ABCD4 порушує цей експорт і спричиняє метилмалонову ацидемію з гомоцистинурією типу cblJ — автосомно-рецесивне порушення обміну B12 з гіпотонією, відставанням у розвитку, пригніченням кісткового мозку, анемією та млявістю. У тваринництві ABCD4 визначили як ген-кандидат за кількістю хребців: GWAS у уjimqin-овець і в пекінських чорних свиней показали зв'язок із числом ребер і хребців.

Молекулярні дані щодо овечого ABCD4 були майже відсутні. Тому автори взяли печінку від двох одномісячних ягнят уjimqin (самці, однаковий вік і стать — для стандартизації матеріалу, не для порівняння статей), виділили тотальну РНК і провели RACE (5′ і 3′) з вкладеними праймерами.

Отримали послідовність cDNA довжиною 1874 п.н. з передбаченою відкритою рамкою зчитування 1209 п.н., що кодує поліпептид із 402 амінокислот. Послідовність зберегла консервативні риси родини ABC-транспортерів, але передбачений білок коротший за канонічні ABCD4 ссавців.

Для антигену конструкцію ABCD4 ввели в E. coli BL21 (DE3). Найвищий рівень експресії отримали після індукції 0,5 мМ IPTG при 37 °C протягом 4 годин. Рекомбінантний білок переважно був у нерозчинній фракції; його очистили афінною хроматографією на Ni-NTA. Очищеним білком імунізували двох здорових самиць новозеландських білих кролів (4 місяці, ~2,1 кг) — виключно для отримання поліклональної антисироватки. Отримані антисироватки дали сильну імунореактивність проти рекомбінантного антигену.

Що це дає практиці: поки це базовий молекулярний ресурс, а не клінічний інструмент. Але послідовність cDNA, рекомбінантний білок і антитіла відкривають шлях до вивчення експресії, локалізації та функції ABCD4 у овець — зокрема в контексті селекції за кількістю хребців і, потенційно, обміну вітаміну B12.