LAMP-тест для польової діагностики колібактеріозу птиці: 45 хвилин, 63 °C, видно оком
Китайські дослідники зробили колориметричний LAMP-тест на патогенну E. coli для зразків від птиці. Реакція йде 45 хв при 63 °C, без термоциклера й гель-електрофорезу. Межа виявлення — 3.6 КУО/мл, це в 1000 разів чутливіше за звичайний PCR. На клінічних зразках — повний збіг із PCR.
Що зробили
Команда з Jilin Academy of Agricultural Sciences (Китай) розробила й оптимізувала візуальний LAMP-тест для виявлення патогенної Escherichia coli у зразках, пов'язаних із птицею. Мета — швидкий скринінг безпосередньо на фермі, без термоциклера й гель-електрофорезу.
Зібрали 650 зразків з 11 великих птахоферм провінції Цзілінь: анальні мазки, послід, вміст сліпих кишок, ґрунт, корм, вода. Виділили 632 бактеріальні ізоляти. Частину вмісту сліпих кишок брали асептично від 30 загиблих курей і гусей із клінічним діагнозом колібактеріозу (перикардит, перигепатит, перитоніт на розтині).
Як працює тест
Дизайн праймерів — чотири набори на консервативні ділянки геному E. coli, підбір через Primer Explorer V5. Кожен набір: F3, B3, FIP, BIP плюс петльові LF і LB.
Реакція — 25 мкл: 2.5 мкл 10× ThermoPol буфера, 3.5 мкл dNTP Mix (10 ммоль/л), 1.5 мкл MgSO₄ (100 ммоль/л), по 1 мкл внутрішніх і зовнішніх праймерів, 2 мкл Bst DNA-полімерази (8 Од/мкл), 1 мкл ДНК-матриці, 3 мкл води без РНКаз. Після інкубації додають 0.5 мкл SYBR Green I.
Оптимізовані умови
- Температура: 63 °C (перевіряли діапазон 61–65 °C з кроком 1 °C).
- Час: 45 хвилин (тестували 15, 30, 45, 60, 75 хв).
- Bst-полімераза: підбирали від 0.1 до 2 мкл з кроком 0.3 мкл.
- Межа виявлення: 3.6 КУО/мл — у 1000 разів нижче, ніж у звичайного PCR.
- Візуалізація: позитивні проби жовто-зелені, негативні — оранжеві. Розрізняється неозброєним оком, підтверджується під УФ (зелена флуоресценція).
Специфічність
Перевіряли на восьми нетаргетних штамах: Leptospira interrogans, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Shigella flexneri. Перехресних реакцій не було.
Клінічна перевірка
200 клінічних зразків прогнали паралельно LAMP і PCR. За золотий стандарт узяли класичну бактеріологічну ізоляцію з культивуванням. Результати LAMP повністю збіглися з PCR.
Що це означає для практики
Тест не потребує ані термоциклера, ані електрофорезу — тільки водяна баня або термостат на 63 °C і око для зчитування кольору. Це реальний варіант для польової діагностики на птахофермі: швидко, дешево, чутливо. Для ветеринарного лікаря на виїзді це означає можливість підтвердити колібактеріоз без відправки зразків у лабораторію й без очікування 2–3 днів на культуральний посів.