П'ять вірусів великої рогатої худоби за один тест: новий мультиплексний qPCR
Китайські дослідники розробили TaqMan-мультиплексний qPCR для одночасного виявлення BVDV, AKAV, BNoV, BEV та BCoV. Метод протестували на 200 зразках з ферм Цзілінь: найчастіше виявляли BVDV (33,5%), далі BCoV (12%) та BEV (7,5%). Збіг із звичайною ПЛР — 100%. Тест чутливий, специфічний і готовий до впровадження в діагностику.
У великої рогатої худоби п'ять вірусів — BVDV, вірус Акабане, бичачий норовірус, бичачий ентеровірус і бичачий коронавірус — часто дають схожу клінічну картину: діарею, блювання, репродуктивні порушення. До того ж вони нерідко циркулюють разом, у вигляді змішаних інфекцій, що ускладнює діагностику. Дослідники з Цзіліньського сільськогосподарського університету розробили мультиплексний TaqMan-qPCR, який за один цикл ампліфікації виявляє всі п'ять патогенів.
Як зроблено
Підібрали пари праймерів і зондів до консервативних ділянок геномів: 5'UTR для BVDV, S-ген для AKAV, RdRp для BNoV, 5'UTR для BEV, N-ген для BCoV. Зібрали мультиплексну реакцію, перевірили на плазмідах-стандартах (pUC57) із вставками відповідних фрагментів. Оцінили специфічність, чутливість і відтворюваність.
Результати на клінічному матеріалі
Метод перевірили на 200 зразках із 10 ферм провінції Цзілінь. Отримали такі показники виявлення:
- BVDV — 33,5%
- BCoV — 12,0%
- BEV — 7,5%
- BNoV — 4,5%
- AKAV — 0,5%
У 9 зразках (4,5%) знайшли одночасно два віруси з п'яти. Порівняння зі звичайною ПЛР показало 100% збіг за всіма п'ятьма патогенами.
Що це означає для практики
Це перший описаний мультиплексний тест саме для цієї п'ятірки вірусів. Він закриває прогалину: раніше такі віруси виявляли по одному або парами, що повільно і дорого. Новий набір дозволяє за один запуск отримати повну картину щодо основних вірусних збудників діареї та респіраторних хвороб у ВРХ.
Для ветеринарної лабораторії це означає економію часу і реактивів. Для практикуючого лікаря — швидке підтвердження діагнозу при змішаних інфекціях, коли клінічна картина не дозволяє визначити збудника. Особливо це актуально для регіонів із високою поширеністю BVDV, як-от Цзілінь, де збудник знаходять у третини тварин.
Обмеження
Автори зазначають, що мультиплексні системи зазвичай трохи менш чутливі, ніж моноплексні, через конкуренцію компонентів реакції. Тому при дуже низьких вірусних навантаженнях можливі хибнонегативні результати. Для підтвердження сумнівних випадків варто дублювати тест або використовувати додаткові методи.