NGS при змішаних інфекціях PRRSV: коли контиги ще можна читати, а коли — ні
Дослідження на 9 штамах PRRSV-2 (3 польові + 6 вакцин) у контрольованих сумішах: NGS правильно визначив склад штамів у 89,7% зразків. Поріг ідентичності 98% для високих концентрацій і 96% для низьких. Провали — переважно там, де 4+ штами. Практичні орієнтири для інтерпретації контигів.
Що робили
Дев'ять вірусів PRRSV-2: три польові ізоляти (L1A 65239GA, L1C.5 01775GA, L1H 81793-6) і шість комерційних MLV-вакцин (Prevacent, Prime Pac, Fostera, Ingelvac MLV, PRRSGard, Ingelvac ATP). Їх змішували в обробній рідині у стандартизованих комбінаціях — різна кількість штамів, різне навантаження (Ct 21 і 27), різні пропорції (зокрема 1:9). Далі — RT-qPCR підтвердження концентрації та NGS зі складанням контигів. Кожен контиг порівнювали з повними референсними геномами.
Ключові цифри
- Правильний склад штамів за контигами — 89,7% зразків.
- Вірус, присутній у концентрації 10% (суміш 1:9 із двох вірусів), NGS виявив у 95,8% (23 з 24) зразків.
- Провали детекції — 10,3% (8 з 78) сумішей. З них 75% (6 з 8) містили чотири і більше штамів. Тобто складність суміші всередині одного виду — головний фактор зниження чутливості.
- NGS не виявляв MLV-вакцини, коли в зразку було два і більше польових вірусів.
- Артефакти складання: 0,7% (8 з 1147) контигів виявились штучними рекомбінантними. Ще 0,61% (7 з 1147) — неоднозначні, бо збігалися з двома дуже близькими вакцинними штамами за ідентичністю понад 98%.
Пороги ідентичності
Ідентичність нуклеотидів контигів до референсу падає разом із вірусним навантаженням. Але навіть на низьких концентраціях віднесення до штаму залишалося точним, якщо застосовувати:
- ≥98% ідентичності — для зразків із високою концентрацією;
- ≥96% — для зразків із низькою концентрацією.
Що це означає для практики
Часткове відновлення геному — не привід одразу перезабирати проби чи перетестовувати. Якщо є референсні послідовності для порівняння і застосовані адекватні пороги ідентичності, склад варіантів PRRSV можна інтерпретувати вже з контигів.
Обережність потрібна у двох ситуаціях:
- Суміші з 4+ штамами — чутливість NGS падає, частину варіантів можна пропустити.
- Вакцини на тлі двох і більше польових вірусів — MLV-компонент може не детектуватися взагалі.
Окремі контиги можуть бути штучними рекомбінантами або неоднозначними (коли два близькоспоріднені вакцинні штами мають >98% збігу). Такі результати не можна трактувати як новий варіант — потрібна перевірка.
Висновок для лабораторій і лікарів: NGS-контиги дають робочу відповідь щодо варіантного складу PRRSV, але тільки за наявності референсних геномів і чітко прописаних порогів ідентичності. Без цього легко або переоцінити склад інфекції, або відкинути валідний результат.