Перші безсмертні клітини мозку коня: що вийшло і де застрягли з iPSC
Італійці вперше виділили первинні клітини з гіпокампа лошати, зробили їх безсмертними через SV40 і спробували перепрограмувати в iPSC трьома неінтеграційними методами. Колоній не отримали. Платформа для майбутніх досліджень нейропатогенів коней є, а от з перепрограмуванням у коней — серйозні труднощі.
Дослідження з Падуанського університету (Італія) — перша спроба створити постнатальні клітинні системи з мозку коня. Матеріал узяли від дводобової кобилки, яку евтаназували через агенезію кишечника. З гіпокампа виділили фрагменти ~0,5 × 0,5 см, дисоціювали папаїном і висадили в середовище DMEM/F-12 з N-2, B-27, GlutaMAX, NEAA, 20 нг/мл hFGF і 20 нг/мл hEGF.
Первинні клітини (EpBCs) успішно розмножили. Далі — безсмертнення: трансфекція плазмідою SV40 large T antigen (pSV3-neo) або hTERT (pCl neo-hEST2) у пасажі 5, з наступною селекцією 350 мкг/мл G418 протягом 4 тижнів. Отримали лінії EiBCs — вони показали активацію клітинного циклу і часткову дедиференціацію за транскриптомом. Проліферацію оцінювали в пасажах 10, 15 і 20 через PrestoBlue.
Перепрограмування в iPSC пробували трьома неінтеграційними підходами: вірус Сендай, епісомні вектори, синтетична мРНК (фактори Яманаки — OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4). Колоній, схожих на iPSC, не отримали за жодних умов.
Автори називають імовірні причини: видоспецифічні особливості, внутрішні властивості самих клітин, характеристики донора, умови культивування, сумісність факторів і ефективність доставки. Тобто проблема не в одному чиннику — це комплекс.
Для практики: маємо готову платформу клітин мозку коня (EpBCs + EiBCs) для вивчення нейропатогенів — східного, західного, венесуельського енцефаліту коней, вірусу Західного Нілу, вірусу Борна. Це також база для порівняльних досліджень нейродегенерацій (Equine Degenerative Myeloencephalopathy, нейроаксональна дистрофія, хвороба мотонейрона коней, мозочкова абіотрофія, альцгеймероподібна патологія) і для майбутніх органоїдів мозку коня.
Обмеження: одна тварина-донор, лише гіпокамп, «brain-derived» тут означає тільки анатомічне походження клітин, а не підтверджену нейрональну чи гліальну ідентичність. Комерційних ліній ESC/iPSC для тварин немає, iPSC з нервових клітин коней досі не отримані.