CircRtn4 як маркер для визначення часу після смерті: перші результати на мозку мишей
Китайські дослідники перевірили circRNA у мозковій тканині мишей при 25 °C і 35 °C та знайшли, що circRtn4 закономірно змінюється з часом після смерті. Для кожної температури потрібні окремі референсні гени й окремі моделі — універсальної формули немає.
Дослідження з Південно-Західного медичного університету (Лучжоу, Китай) присвячене оцінці посмертного інтервалу (PMI) — часу між смертю і виявленням тіла. Класичні методи (охолодження, трупні плями, заклякання, ентомологія) працюють переважно в перші 24 години і сильно залежать від умов. Автори шукали стабільніший молекулярний маркер — кільцеві РНК (circRNA), які мають замкнену структуру, не мають 5'-кепа й 3'-полі(А)-хвоста, стійкі до RNase R і мають довгий період напіврозпаду.
Що робили. Відібрали кандидатні circRNA та референсні гени з баз circBase, circBank, TSCD, NCBI і GTEx. Місця back-splice з'єднання підтвердили секвенуванням за Сенгером. Тотальну РНК виділяли з мозкової тканини мишей, які зберігалися при 25 °C і 35 °C, та з людських зразків при 20 °C і 25 °C, у різні моменти після смерті. Рівні circRNA вимірювали напівкількісним RT-PCR і RT-qPCR, далі будували лінійні й нелінійні регресійні моделі та перевіряли їх на зразках із відомим PMI.
Ключові результати.
- При 25 °C мРНК деградувала швидше за інші протестовані РНК.
- За посмертною стабільністю для моделі при кімнатній температурі обрали референсні гени 28S rRNA, mt-co1 і circCDR1as; при високій температурі — лише 28S rRNA і mt-co1.
- CircRtn4 (mmu_circ_0000250) змінювався з PMI за обох температурних умов.
- У напівкількісному RT-PCR для даних при 25 °C, нормалізованих на 28S rRNA і circCDR1as, краще підходили квадратичні моделі; для mt-co1 при 25 °C і для обох референсів при 35 °C — лінійні. Додавання кубічних членів нічого не покращувало.
- У RT-qPCR при 25 °C статистично значущий зв'язок із PMI показала лише лінійна модель.
- Перевірка на зразках із відомим PMI дала різні похибки залежно від моделі та часової точки.
- Для людини (один донор) побудували орієнтовні рівняння регресії при 20 °C і 25 °C для гомологічної circRTN4 (has_circ_0054598).
Що це означає для практики. CircRtn4 можна розглядати як кандидатний маркер PMI в мозковій тканині мишей, але тільки в межах конкретних температурних умов. Моделі, побудовані за однієї температури, не переносяться на іншу — це принципово. Референсні гени теж доводиться підбирати під умови зберігання.
Автори прямо зазначають: перед будь-яким судовим застосуванням потрібна незалежна валідація на ветеринарно значущих видах і на людських когортах. Людська частина тут — лише розвідувальна, на одному донорі, тож висновків із неї робити не можна.