Проточна цитометрія в конярстві: що вже працює, а що поки лише в дослідженнях

Проточна цитометрія — кількісний метод аналізу окремих клітин у суспензії, відомий з 1960-х. Одночасно оцінює розмір і гранулярність клітини, життєздатність (за цілісністю мембрани або метаболічною активністю) та експресію поверхневих і внутрішньоклітинних маркерів через флуоресцентно мічені антитіла. Цитометр має кілька лазерів з різними довжинами хвиль, оптичну систему з фотодетекторами і модуль гідродинамічного фокусування, який вишиковує клітини в один ряд.

Матеріал для аналізу: периферична кров, кістковий мозок, бронхоальвеолярна лаважна рідина (БАЛ), аспірати з органів і пухлин, сперма, рідини порожнин тіла, культивовані лінії клітин.

У гуманній медицині метод давно валідований для рутинної діагностики, є навіть спеціальні діагностичні цитометри. У коней усе інакше: цитометрія залишається переважно дослідницьким інструментом, стандартизованих і валідованих протоколів для клініки бракує. Перший огляд на цю тему вийшов 2002 року (Davis et al.), за два десятиліття розуміння методу й клінічне впровадження в гіпіатрії суттєво зросли.

Основні клінічні напрями в коней:

• клінічна імунологія — імунофенотипування лімфоцитів периферичної крові;
• онкологія — фенотипування пухлинних клітин з крові, кісткового мозку, аспіратів лімфовузлів;
• внутрішня медицина — цитометрія БАЛ-рідини;
• андрологія — оцінка якості сперми жеребців.

Імунофенотипування базується на прямих або непрямих методах імунофлуоресценції. Антигени субпопуляцій (CD) виявляють антитілами, кон'югованими з флуорохромом, або через мічену вторинну сироватку. Раніше рутинне застосування стримувала нестача моноклональних антитіл, перехресно реагуючих з лейкоцитами коней. З 1990-х панель розширили: спершу CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11a/18, CD13, CD44, MHC I і II, далі CD19 і CD28, потім CD18, CD29 і DR. Нещодавно з'явилась можливість фенотипувати регуляторні T-клітини коней — за позаклітинним CD25 у комбінації з внутрішньоклітинним транскрипційним фактором FoxP3.

Кілька практичних нюансів з панелі антитіл:

• CD3 — пан-T-маркер, основний для ідентифікації всієї популяції T-лімфоцитів коней.
• Клон CVS21 проти CD8 частково розпізнає CD3− лімфоцити з CD21 і поверхневим IgG. Якщо використовуєте цей клон, мітьте разом із CD3+, інакше не відрізните T-клітини від CD3− популяцій.
• CD13 експресується на мієлоїдних клітинах (нейтрофіли, базофіли, моноцити, фібробласти, епітелій нирок, ендотелій, мезенхімальні стовбурові клітини), але не на лімфоїдних. Корисний для розмежування мієлоїдних і лімфоїдних ліній у пухлинах кровотворної системи.
• CD14 у комбінації з анти-IgE дозволяє виділити CD14−IgE+ популяцію — базофіли й опасисті клітини.
• Для B-клітин коней досі немає широко реактивного лінійного маркера, аналогічного людському CD19 чи CD79a. Антитіло до епітопу CZ2.1 мітить B-лімфоцити коней, але повноцінної заміни людським маркерам немає.

Висновок для практики: метод має потенціал закрити діагностичні прогалини й доповнити базові методи діагностики, але поки що більшість аналізів виконують у дослідницьких центрах. Для рутинної клініки в коней бракує стандартизації та валідації.