Гібридизація in situ вірусу лейкемії котів у випадку остеохондроматозу

Anna Szilasi ¹ , Zsófia Koltai ² , Lilla Dénes ¹ , Gyula Balka 1,* and Míra Mándoki ¹

¹ Кафедра патології, Університет ветеринарної медицини, 1078 Будапешт, Угорщина; szilasi.anna@univet.hu (A.S.); denes.lilla@univet.hu (L.D.); mandoki.mira@univet.hu (M.M.)
² Ветеринарна клініка DUO-VET, 1078 Будапешт, Угорщина; zskoltai@gmail.com
* Автор-кореспондент: balka.gyula@univet.hu; Тел.: +36-1-478-41-81

Анотація: Остеохондроматоз, також відомий як множинний хрящовий екзостоз, поліостотична остеохондрома та множинні остеохондроми, становить одну п'яту всіх первинних пухлин кісток у котів, без породної чи статевої схильності або спадкового характеру. На відміну від собак, коней та людей, він переважно спостерігається у молодих котів (2–4 роки), після дозрівання скелета. Хоча патогенез остеохондроматозу не повністю з'ясований, вважається, що він пов'язаний з інфекцією вірусом лейкемії котів (FeLV) або іншими ретровірусами, такими як вірус саркоми котів. Однак наявність вірусних частинок у пухлинних ураженнях була продемонстрована лише за допомогою електронної мікроскопії. Злоякісна трансформація остеохондром, найчастіше в остеосаркому або хондросаркому, також приписується вірусній інфекції. Тут ми повідомляємо про випадок остеохондроматозу в 3,5-річного самця домашнього європейського короткошерстого кота з супутньою інфекцією FeLV, підтвердженою полімеразною ланцюговою реакцією. Вірусну РНК було візуалізовано в репрезентативних тканинах (селезінка, мезентеріальний лімфатичний вузол, печінка, нирка, легеня, головний мозок) та в остеохондромах за допомогою RNAscope in situ гібридизації, що підтверджує, що інфекція FeLV може бути залучена до патогенезу остеохондроматозу.

Ключові слова: остеохондроматоз; FeLV; гібридизація in situ; коти

Цитування: Szilasi, A.; Koltai, Z.; Dénes, L.; Balka, G.; Mándoki, M. Гібридизація in situ вірусу лейкемії котів у випадку остеохондроматозу. Vet. Sci. 2022, 9, 59.

Академічний редактор: Louise van der Weyden

Отримано: 15 грудня 2021 р. Прийнято: 29 січня 2022 р. Опубліковано: 31 січня 2022 р.

Примітка видавця: MDPI зберігає нейтралітет щодо юрисдикційних претензій у опублікованих картах і інституційних приналежностях.

Авторське право: © 2022 автори. Ліцензія MDPI, Базель, Швейцарія. Ця стаття є статтею відкритого доступу, що розповсюджується на умовах ліцензії Creative Commons Attribution (CC BY) (https:// creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/).

1. Вступ

Остеохондроматоз, також відомий як множинний хрящовий екзостоз, поліостотична остеохондрома та множинні остеохондроми, становить 20% усіх первинних пухлин кісток у котів, без породної чи статевої схильності або спадкового характеру. Це рідкісний стан у котів, з лише кількома описами та клінічними випадками в доступній літературі [1 –6]. Термін остеохондроматоз позначає захворювання, при якому множинні доброякісні пухлини, вкриті хрящем, виникають з поверхонь кісток внаслідок ендохондрального окостеніння. Крім котів, захворювання було описано у свиней, коней, собак та макак [7 –11]. Синдром демонструє сімейний/спадковий характер у коней, собак та свиней, подібно до людей, і зазвичай виникає у молодих тварин у період активного росту кісток [12,13].

Котячий остеохондроматоз має іншу патофізіологію, клінічний перебіг і, найімовірніше, іншу етіологію: він переважно спостерігається в молодих котів, де найчастіше діагностується у віці 2–4 років [2], коли скелет уже сформований. Більше того, за невеликими винятками [5,6,14], котячий остеохондроматоз зазвичай виявляють у котів, інфікованих вірусом котячої лейкемії (FeLV) [1,3,4]. Ретровірусні частинки типу C, що нагадують FeLV та вірус котячої саркоми, були виявлені за допомогою електронної мікроскопії в хрящових ковпачках котів з остеохондроматозом [1 ,15]. Імовірно, інфікування періостальних фібробластів FeLV пов'язане з особливим патогенезом котячого остеохондроматозу [16]. Однак роль інфікування FeLV у розвитку цього захворювання не була повністю з'ясована. Вірусна етіологія могла б пояснити відмінності в проявах захворювання у котів порівняно з іншими видами.

Vet. Sci. 2022, 9, 59 2 з 8

У котів захворювання уражає осьовий скелет, найчастіше грудну клітку, лопатки, хребетний стовп, череп, таз і кінцівки. Пухлини при котячому остеохондроматозі демонструють прогресуючий ріст і можуть суттєво погіршувати якість життя уражених пацієнтів. Більше того, може відбуватися малігнізація в остеосаркому або хондросаркому [6 ,17]. У уражених котів можуть виникати виражені клінічні ознаки, зокрема кульгавість та неврологічні ознаки у разі залучення хребта. Як лікування тимчасове місцеве покращення може бути досягнуте шляхом паліативного хірургічного зменшення об'єму новоутворень, але остеохондроматоз (і супутня інфекція FeLV) не піддається вилікуванню, і стан зазвичай призводить до евтаназії [2,17]. Зареєстрована тривалість виживання зазвичай становить менше року після встановлення діагнозу [6].

Патогенез остеохондроматозу котів вивчений не повністю, а супутню інфекцію FeLV у деяких випадках було підтверджено лише з периферичної крові методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Наявність геному FeLV було виявлено в пухлинах за допомогою електронної мікроскопії [1 ,4]. Цей стан зазвичай пов'язують з інфекцією FeLV, хоча точна роль інфекції у патогенезі захворювання ще не з'ясована.

Для візуалізації FeLV-інфекції в гістологічних зрізах уже використовувалися кілька методів, зокрема електронна мікроскопія, імуногістохімія та флуоресцентна гібридизація in situ [18 –20]. RNAscope in situ гібридизація (ISH) — це новітній метод, заснований на виявленні молекул РНК у зразках тканин [21]. RNAscope має вищу чутливість порівняно з класичною ISH, що уможливлює виявлення низького вірусного навантаження з надзвичайною специфічністю. Крім того, він забезпечує дуже точну локалізацію та візуалізацію типу інфікованих клітин.

Основною метою нашого дослідження було описати випадок 3,5-річного кота європейської короткошерстої породи, ураженого остеохондроматозом, та виявити наявність FeLV RNA у тканині пухлини й інших органах за допомогою новітньої методики гібридизації in situ RNAscope [22].

2. Клінічний випадок

3,5-річний кастрований самець європейської короткошерстої кішки був прийнятий до ветеринарної клініки, де під час повного загального фізикального обстеження за лівою лопаткою було помічено невеликий (1 см у діаметрі) щільний вузол. Вузол було чітко видно при рентгенографічному дослідженні — спостерігалося кальцифіковане, рентгенщільне та добре відмежоване утворення. На той час кішка не виявляла інших клінічних симптомів. Через вісім місяців обсяг рухів обох передніх кінцівок був дещо зменшений, оскільки в ділянці грудних хребців і грудини, а також на грудній клітці (з обох боків) виросло кілька інших новоутворень. За словами власника, прогресування захворювання було безперервним. Згідно з рентгенівським скануванням, ці пухлини являли собою щільні, кальцифіковані, помірно відмежовані кісткові структури, деякі з них виступали в грудну порожнину (Рисунок 1). Лабораторні дослідження, включаючи загальний аналіз крові (ЗАК) та біохімічний профіль сироватки, показали помірно знижений рівень загального білка та підвищені рівні сечовини й креатиніну, що вказувало на ниркову недостатність стадії IRIS2 (Міжнародне товариство з вивчення нирок у тварин). Інші показники крові були в межах фізіологічних норм. Під час ультразвукового дослідження черевної порожнини не було виявлено відхилень або ознак подальшого метастазування. Відомий FeLV-позитивний статус тварини було повторно підтверджено з периферичної крові за допомогою тесту Witness FeLV-FIV (Zoetis, Parsippany–Troy Hills, NJ, USA). Кішка не була вакцинована проти FeLV; вона отримувала лише регулярні комбіновані вакцинації (проти вірусу панлейкопенії кішок, каліцивірусу кішок та герпесвірусу кішок 1). Після остаточного діагнозу остеохондроматозу кішок, через несприятливий прогноз, пацієнта було піддано евтаназії гуманним методом.

Тушу кота було доставлено до кафедри патології Університету ветеринарної медицини, Будапешт, для некропсії. Макроскопічне післясмертне дослідження кота виявило множинні, великі, щільні утворення (найменше — 3 см, найбільше — 8 см у діаметрі), з'єднані з грудною кісткою (sternum), ребрами (ribs) та грудними хребцями (thoracic vertebrae) тварини (Рисунок 2). Печінка була помірно збільшена, жовтіша за норму, що свідчить про легку стеатогепатопатію. Усі інші органи виглядали нормальними.

Vet. Sci. 2022, 9, 59 3 з 8

Рисунок 1. Рентгенографічне дослідження виявило кальцифіковані, помірно демарковані пухлинні ураження (зірочки), що випиналися в грудну порожнину, деформуючи нормальні структури скелета.

Рисунок 2. Ураження при остеохондроматозі: (A) пухлини, що походять з кісток (хребців і ребер); (B) поверхня розтину того самого ураження, що переважно представлена кістковою речовиною, але також можна було спостерігати сірувато-коричневу хрящову тканину.

Vet. Sci. 2022, 9, 59 4 з 8

2.1. Матеріали та методи

Репрезентативні зразки пухлин і всіх основних органів (селезінка, печінка, нирка, тонкий і товстий кишечник, мезентеріальний лімфатичний вузол, підшлункова залоза, надниркові залози, серце, легені, щитоподібні залози та головний мозок) фіксували в 10% нейтральному забуференому формаліні протягом 24 год за кімнатної температури. Кісткові новоутворення декальцинували в розчині мурашиної кислоти (37% HCl, 99% HCOOH, H2O) протягом 4 днів перед подальшою обробкою. Зрізи, фіксовані формаліном і залиті в парафін, забарвлювали гематоксиліном та еозином і піддавали рутинному гістологічному дослідженню.

Наявність генетичного матеріалу FeLV у досліджуваних тканинах перевіряли двома методами: ПЛР та гібридизацією in situ RNAscope. Для полімеразної ланцюгової реакції за кінцевою точкою окремо досліджували пул свіжих тканин (брижовий лімфатичний вузол, печінка, селезінка), кістковий мозок та проліферативне ураження. Зразки органів і пухлини гомогенізували за допомогою TissueLyser LT (Qiagen, Hilden, Germany), а після центрифугування РНК виділяли з супернатанту в автоматичному приладі QIAcube (Qiagen, Hilden, Germany) з використанням набору QIAmp cador Pathogen Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) згідно з інструкціями виробника. Прямий 5⁰ -AACAGCAGAAGTTTCAAGGCC-3⁰ та зворотний праймери 5⁰ -TTATAGCAGAAAGCGCGCG-3⁰ ампліфікували провірусну ДНК (продукти ранньої стадії) процесу зворотної транскрипції вірусу [23]. Реакції проводили з використанням набору One-Step RT-PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany) у градієнтному ПЛР-апараті Genesy 96T (Tianlong, Xi'an, China). Відомий позитивний зразок використовували як позитивний контроль. Реакційна суміш без додавання будь-якої нуклеїнової кислоти слугувала негативним контролем. Мастер-мікс, що містив 5,7 мл води, вільної від РНКаз, 2 мл 5^× буфера (кінцева концентрація: 1×), 0,4 мл суміші dNTP (кінцева концентрація: 400 ^µM кожного dNTP), 0,4 мл суміші ферментів (концентрація виробником не вказана), 0,1 мл інгібітора РНКаз (кінцева концентрація: 5 одиниць/реакція), по 0,2 мл прямого та зворотного праймерів (40 ^µM; кінцева концентрація: 0,6 ^µM), додавали в пробірки з 0,5 мл зразка. Термічні умови становили 50 ◦C протягом 30 хв та 94 ◦C протягом 3 хв на стадії зворотної транскрипції та початкової денатурації; 95 ◦C протягом 15 сек та 60 ◦C протягом 1 хв і 72 ◦C протягом 1 хв на стадії 2 (45 циклів); 72 ◦C протягом 10 хв. Потім реакційну суміш ПЛР піддавали електрофорезу в агарозному гелі, а амплікони візуалізували під УФ-світлом.

Для аналізу RNAscope ISH 5 ^µm тонких зрізів було нарізано та змонтовано на слайди Super-Frost Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [21]. Етапи ISH виконували згідно з інструкціями виробника вручну (з використанням набору RNAscope 2.5 high definition (HD) red kit; Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA, USA), як описано раніше [22]. Коротко, зрізи депарафінізували у ксилолі (2 ^× 5 хв), потім для регідратації використовували серію 96% спирту (2 ^× 3 хв). Після 10 хв інкубації в перекисі водню за кімнатної температури зрізи піддавали впливу буфера для демаскування протягом 15 хв за 95–102 ◦C та обробляли протеазою за 40 ◦C протягом 30 хв. Етап гібридизації з цільовими РНК-специфічними олігонуклеотидними зондами для FeLV (RNAscope Probe-V-FELV-env (каталожний номер 491001)), позитивним контролем для господарських генів (RNAscope positive control probe Fc-PPIB (каталожний номер 455011)) та бактеріальним негативним контролем (RNAscope negative control probe-DapB (каталожний номер 310043)) проводили протягом 2 год за 40 ◦C. Етапи ампліфікації сигналу (з ампліфікаторами 1–6) виконували після гібридизації згідно з інструкціями виробника. Мічені зонди, що містять червоний хромогенний фермент, зв'язуються з численними сайтами зв'язування на ампліфікаторах. Для контрфарбування використовували обробку модифікованим гематоксиліном Гілла II протягом 1 хв, а слайди накривали покривними скельцями після 15–20 хв сушіння на повітрі за 60 ◦C. Кожна окрема цільова молекула вірусної РНК-транскрипту візуалізувалася під світловим мікроскопом як чітка точка червоного хромогенного преципітату.

Скельця сканували за допомогою приладу для сканування скелець Pannoramic Midi II (3DHistech, Budapest, Hungary), цифрові скельця аналізували, а репрезентативні зображення отримували за допомогою програмного забезпечення SlideViewer (3DHistech, Budapest, Hungary).

Vet. Sci. 2022, 9, 59 5 з 8

2.2. Результати

Гістопатологічне дослідження репрезентативних зразків, отриманих з кісткових пухлин, виявило численні неправильної форми острівці добре диференційованого гіалінового хряща, оточені остеоїдною тканиною та кістковими трабекулами, що походять з ендохондрального окостеніння (Рисунок 3). Рутинне гістопатологічне дослідження відібраних органів із забарвленням гематоксиліном та еозином виявило лише легкі патологічні ураження: легку дифузну мікровезикулярну стеатогепатопатію в печінці, мультифокальну нодулярну гіперплазію в підшлунковій залозі та легке лімфоїдне виснаження й паракортикальну гіперплазію в брижовому лімфатичному вузлі. Ми не виявили жодних змін у зрізах нирок, які могли б пояснити підвищені рівні сечовини та креатиніну в периферичній крові.

Рисунок 3. Гістопатологічна картина котячого остеохондроматозу (забарвлення гематоксиліном та еозином, збільшення 100^×, масштабна лінійка = 200 ^µм). Кісткові трабекули (стрілки) оточені острівцями хряща (зірочки).

Кожен зразок тканини (пул органів (брижовий лімфатичний вузол, печінка, селезінка), кістковий мозок та проліферативне ураження, досліджені окремо) був позитивним щодо провірусної ДНК FeLV методом ПЛР. Гібридизація in situ RNAscope також підтвердила наявність РНК FeLV у кожній проаналізованій тканині (печінка, селезінка, нирка, брижовий лімфатичний вузол, легеня, головний мозок, остеохондрома). Кістковий мозок не досліджували методом ISH. На зрізах спостерігалися мультифокально розподілені, поодинокі або зливні червоні точки в різній кількості: велику кількість РНК-позитивних клітин вірусу (переважно лімфоцити та інші лімфоїдні клітини) виявлено в селезінці, брижовому лімфатичному вузлі та печінці. Менша кількість була присутня у фронтальній ділянці головного мозку (Рисунок 4), нирці та легенях. Хоча й у значно меншій кількості порівняно з іншими органами, РНК-позитивні клітини FeLV були виявлені спорадично також у декальцифікованих остеохондроматозних ураженнях (Рисунок 5). Позитивні клітини знаходили в кістковому компартменті, найімовірніше, в цитоплазмі остеобластів. Для порівняння впливу декальцифікації на тканини позитивний контрольний аналіз ISH було проведено на тій самій декальцифікованій пухлинній тканині — лише кілька ендотеліальних клітин та клітин сполучної тканини були ідентифіковані як позитивні.

Vet. Sci. 2022, 9, 59 6 з 8

Рисунок 4. Зразки тканин від кота, евтаназованого через остеохондроматоз, FeLV ISH (збільшення $100 \times (\mathbf{A}, \mathbf{C})$, масштабна лінійка = $200 \ \mu \text{m}$; $50 \times (\mathbf{B}, \mathbf{D})$; масштабна лінійка = $500 \ \mu \text{m}$). Червоні преципітати хромогену видно в (A) печінці, (B) селезінці, (C) головному мозку та (D) тканинах брижового лімфатичного вузла (mesenteric lymph node), у FeLV-інфікованих клітинах.

Рисунок 5. Зразок пухлини від кота, евтаназованого через остеохондроматоз, FeLV ISH, збільшення $400\times$, масштабна лінійка = $50~\mu m$. Стрілки вказують на дві позитивно мічені клітини (імовірно остеобласти) в пухлині. Вставка: ті самі клітини за більшого збільшення: видно преципітати червоного хромогену, що свідчить про наявність FeLV RNA. (Збільшення $1000\times$, масштабна лінійка = $20~\mu m$).

Vet. Sci. 2022, 9, 59 7 з 8

3. Обговорення

3,5-річного кастрованого кота домашньої європейської короткошерстої породи евтаназували через прогресуючу проліферацію великих кісткових мас, з'єднаних з грудиною, ребрами та хребетним стовпом тварини. Згідно з анамнезом пацієнта, клінічними ознаками, лабораторними результатами, макроскопічними та мікроскопічними ураженнями та FeLV-позитивним статусом кота, було встановлено остаточний діагноз котячого остеохондроматозу. Представлений випадок є першим, у якому вдалося успішно візуалізувати геном FeLV у новоутвореннях остеохондроматозу за допомогою RNAscope in situ гібридизації. Більше того, ми змогли виявити вірус у тканинах без тяжких гістопатологічних уражень, таких як печінка, селезінка, нирка, мезентеріальний лімфатичний вузол, легеня та головний мозок. Попередні звіти підтверджували наявність FeLV у периферичній крові уражених тварин переважно методом ПЛР [3 ,4], хоча в межах пухлин остеохондроматозу наявність частинок, схожих на ретровіруси, спостерігали лише за допомогою електронної мікроскопії [1,4]. Специфічного виявлення та візуалізації вірусного геному досі не повідомлялося; більше того, раніше були описані випадки FeLV-негативних котів з остеохондроматозом [5,6], що порушує питання про внесок FeLV у патогенез цього стану. Наявність червоного сигналу, тобто кількість FeLV-позитивних клітин, була відносно низькою в ураженнях, але дуже високою в селезінці, лімфатичному вузлі та печінці. Це спостереження можна пояснити двома шляхами: (a) в остеохондроматозних тканинах є лише кілька клітин-мішеней для FeLV, або (b) інфіковані ще не ідентифіковані клітини та типи клітин, але розчин мурашиної кислоти під час процесу декальцифікації деградує РНК, що призводить до втрати чутливості [24]. У майбутньому слід протестувати додаткові методи та/або інші типи декальцифікаторів, щоб визначити, чи мають вони менший вплив на RNAscope ISH, а отже, і на візуалізацію вірусної РНК у кісткових ураженнях. Демонстрабельність вірусного геному, ймовірно, була ускладнена через декальцифікацію мурашиною кислотою (і, отже, деградацію РНК FeLV), що було підтверджено використанням позитивного контрольного зонда для господарських генів [23], але цей етап є неминучим при обробці кісткових тканин. Використання інших декальцифікуючих агентів (наприклад, EDTA) слід розглянути у разі можливих додаткових досліджень, окрім рутинної гістопатології.

Наявність ретровірусних частинок in situ у межах пухлин була продемонстрована лише за допомогою електронної мікроскопії. В одному повідомленні імуногістохімія не виявила антигени FeLV у пухлинних клітинах, тоді як позитивність спостерігалася в гемопоетичних клітинах кісткового мозку [4]. У цьому випадку із застосуванням аналізу RNAscope ISH РНК FeLV було виявлено також у пухлинах, хоча й у малій кількості, що може стати кроком уперед до подальшого з'ясування ролі FeLV в етіології котячого остеохондроматозу. RNAscope — це чутливий і специфічний метод виявлення РНК, який може бути великою перевагою під час дослідження інфекційних захворювань або вірусного онкогенезу. Недоліком є те, що цей метод поки що дуже дорогий, а тому використовується переважно для дослідницьких цілей, а не в рутинній діагностиці.

Внесок авторів: Концептуалізація, A.S. та G.B.; методологія, A.S., Z.K. та G.B.; програмне забезпечення, L.D.; валідація, A.S., M.M. та G.B.; формальний аналіз, A.S.; дослідження, A.S.; ресурси, A.S., M.M. та G.B.; написання — підготовка первинного чернетки, A.S. та G.B.; написання — рецензування та редагування, Z.K. та M.M.; візуалізація, L.D. та A.S.; супервізія, G.B. та M.M. Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.

Фінансування: Дьюла Балка (Gyula Balka) отримав підтримку за програмою дослідницької стипендії Яноша Бояї (János Bolyai Research Scholarship) Угорської академії наук.

Заява про схвалення інституційною наглядовою радою: Не застосовно. Відповідно до законодавства Угорщини, узгодженого з нормами ЄС (Закон XXVIII від 1998 року; Постанова 40/13), цей випадок не містив досліджень на тваринах; наші обстеження не проводилися на живій тварині.

Заява про інформовану згоду: Не застосовно.

Заява про доступність даних: Не застосовно.

Подяки: Ми хотіли б подякувати Renáta Pop та Kitti Schönhardt за допомогу в гістологічній роботі.

Конфлікт інтересів: Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Vet. Sci. 2022, 9, 59 8 з 8

Література

1. Pool, R.R.; Carrig, C.B. Множинні хрящові екзостози в кота. Vet. Pathol. 1972, 9, 350–359. [PubMed]
2. Thompson, K.G.; Pool, R.R. Пухлини кісток. У Tumors in Domestic Animals, 5-те вид.; Meuten, D.J., Ed.; John Wiley & Sons, Inc.: Ames, IA, USA, 2017; с. 368–369.
3. Rosa, C.; Kirberger, R.M. Екстраскелетна остеохондрома на лікті кота. J. S. Afr. Vet. Assoc. 2012, 83, 104.
4. de Oliveira Reis, M.; Santos de Mello, L.; Hesse, K.L.; Lorenzett, M.P.; dos Reis, K.D.H.L.; Campos, F.S.; Roehe, P.M.; Pavarin, S.P. Остеохондрома в молодого кота, інфікованого вірусом лейкозу котів. Ciênc. Rural 2017, 47, 1.
5. Nolff, M.C.; Puff, C.; Länger, B.; Fehr, M. Остеохондроматоз котів у FeLV-негативного європейського короткошерстого кота. Tierärztliche Prax. Kleintiere 2014, 42, 55–59.
6. Levitin, B.; Aroch, I.; Aizenberg, I.; Foreman, O.; Shamir, M. Лінійний остеохондроматоз у кота. Vet. Radiol. Ultrasound 2003, 44, 660–664.
7. de Brot, S.; Grau-Roma, L.; Vidal, E.; Segales, J. Виникнення остеохондроматозу (множинних хрящових екзостозів) у свійської свині (Sus scrofa domesticus). J. Vet. Diagn. Investig. 2013, 25, 599–602.
1. Franch, J.; Font, J.; Ramis, A. Множинні хрящові екзостози в цуценяти помісі золотистого ретривера. Клінічні, рентгенографічні та дані зворотньорозсіювальної сканувальної мікроскопії. Vet. Comp. Orthop. Traumatol. 2005, 18, 189–193.
1. Leone, N.C.; Shupe, J.L.; Gardner, E.J. Спадкові множинні екзостози. Порівняльне людсько-кінсько-епідеміологічне дослідження. J. Hered. 1987, 78, 171–177.
1. Matthews, K.A.; Strait, K.; Connor-Stroud, F.; Courtney, C.L. Остеохондроматоз у макаки-резус (Macaca mulatta). Comp. Med. 2012, 62, 149–152.
11. Unni, K.K. Хрящові ураження кістки. J. Orthop. Sci. 2001, 6, 457–472.
12. Chester, D.K. Множинні хрящові екзостози у двох поколіннях собак. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1971, 159, 895–897.
13. Mozos, E.; Novales, M.; Ginel, P.J.; Pérez, J.; Pool, R.R. Нещодавно визнаний патерн остеохондроматозу в собак. Vet. Radiol. Ultrasound 2005, 43, 132–137.
14. Wood, B.C.; Grant, D.C.; McKlveen, T.L. Який ваш діагноз? J. Am. Vet. Med. Assoc. 2002, 221, 939–940.
15. Pool, R.R.; Harris, J.M. Остеохондроматоз котів. Feline Pract. 1975, 5, 24–30.
16. Dernell, W.S.; Ehrhart, N.P.; Straw, R.C.; Vail, D.M. Пухлини скелетної системи. У Withrow & MacEwen's Small Animal Clinical Oncology, 4-те вид.; Withrow, S.J., Vail, D.M., Eds.; Elsevier Saunders: St Louis, MO, USA, 2005; с. 540–574.
17. Harasen, G.L.G.; Little, S.E. Захворювання опорно-рухового апарату. У The Cat, 1-ше вид.; Little, S.E., Ed.; Elsevier: Ottawa, ON, Canada, 2011; с. 726–730.
18. Hardy, W.D.; Geering, J.G.; Old, L.J.; de Harven, E.; Brodey, R.S.; McDonough, S. Вірус лейкозу котів: виявлення вірусного антигену в тканинах котів з лімфосаркомою та іншими захворюваннями. Science 1969, 166, 1019–1021.
1. Jackson, M.L.; Haines, D.M.; Meric, S.M.; Misra, V. Виявлення вірусу лейкозу котів методами імуногістохімії та полімеразної ланцюгової реакції у фіксованій формаліном, залитій парафіном пухлинній тканині котів з лімфосаркомою. Can. J. Vet. Res. 1993, 57, 269–276.
20. Fujino, Y.; Satoh, H.; Hisasue, M.; Masuda, K.; Ohno, K.; Tsujimoto, H. Виявлення інтегрованих вірусів лейкозу котів у лімфоїдній пухлинній клітинній лінії кота методом флуоресцентної гібридизації in situ. J. Hered. 2003, 94, 251–255.
21. Wang, F.; Flanagan, J.; Su, N.; Wang, L.; Bui, S.; Nielson, A.; Wu, X.; Vo, H.; Ma, X.; Luo, Y. RNAscope: нова платформа аналізу РНК in situ для фіксованих формаліном, залитих парафіном тканин. J. Mol. Diagn. 2012, 14, 22–29.
22. Szilasi, A.; Dénes, L.; Jakab, C.; Erdélyi, I.; Resende, T.; Vannucci, F.; Csomor, J.; Mándoki, M.; Balka, G. Гібридизація in situ вірусу лейкозу котів у первинній нейральній B-клітинній лімфомі. J. Vet. Diagn. Investig. 2020, 32, 454–457.
23. Tandon, R.; Cattori, V.; Gomes-Keller, M.A.; Meli, M.L.; Golder, M.C.; Lutz, H.; Hofmann-Lehmann, R. Кількісне визначення вірусного та провірусного навантаження вірусу лейкозу котів методом Taq-Man® полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. J. Virol. Methods 2005, 130, 124–132.
24. Walsh, L.; Freemont, A.J.; Hoyland, J.A. Вплив декальцифікації тканини на збереження мРНК у кістці для досліджень гібридизації in situ. Int. J. Exp. Pathol. 1993, 74, 237–241. [PubMed]

Гібридизація in situ вірусу лейкемії котів при остеохондроматозі