Вересень 2002 Madhavan et al – Амніотична мембрана для реконструкції очної поверхні ²²⁷ Офтальмологічна практика

Приготування амніотичної мембрани (amniotic membrane) для реконструкції поверхні ока (ocular surface)

Hajib N Madhavan, MD, PhD; K Priya, MS, MLT; J Malathi, MS, MLT; Patricia R Joseph, BSc, DMLT

Ми описуємо приготування та збереження амніотичної мембрани людини (human amniotic membrane), необхідної для трансплантації під час лікування захворювань очної поверхні (ocular surface diseases). Отримують інформовану згоду та проводять скринінг донора для виключення ризику трансмісивних інфекцій, таких як вірус імунодефіциту людини (HIV), вірус гепатиту B, вірус гепатиту C та інфекції Treponema pallidum . В ідеалі середовища та промивні розчини (washing solutions), потрібні для приготування амніотичної мембрани, готують лише за тиждень–10 днів до використання і не зберігають у морозильній камері за тижні до цього. Амніотичну мембрану (AM), отриману в стерильних умовах після планового кесаревого розтину (elective caesarian section), відмивають від згустків крові та хоріона (chorion). Епітеліальною поверхнею догори амніотичну мембрану рівномірно розкладають без складок і розривів на окремо стерилізованих нітроцелюлозних мембранах (nitrocellulose membranes) розміром 0,22 µм потрібних розмірів. Підготовлену фільтрувальну мембрану (filter membrane) з прилеглою амніотичною мембраною поміщають у консервувальне середовище (preservative medium) і зберігають при –80°C. Мембрани вивільняють, коли повторна серологія на HIV після вікна періоду (window period) виключила вірусну інфекцію в донора. Залежно від витрати їх можна використовувати до 6 місяців після приготування, хоча багато хто рекомендував зберігання протягом невизначеного періоду. Оскільки амніотична мембрана має лише неповну експресію антигенів HLA, а амніотичні епітеліальні клітини (amniotic epithelial cells) їх не експресують, вона не відторгається після трансплантації. Наявність кількох цитокінів (cytokines) в амніотичній мембрані сприяє епітелізації (epithelialization) зі зменшенням фіброзу (fibrosis) під час загоєння.

Ключові слова: амніотична мембрана, приготування, реконструкція поверхні ока

Indian J Ophthalmol 2002;50:227-31

Протягом останніх кількох років зростає попит на трансплантацію амніотичної мембрани (amniotic membrane, AM) для лікування захворювань очної поверхні. Упродовж останніх двох років ми готували AM у нашій офтальмологічній лікарні третинного рівня для використання офтальмологами. У цьому повідомленні розглянуто біологічні властивості, що становлять основу трансплантації AM, і зроблено спробу надати практичні настанови та необхідне лабораторне обладнання для заготівлі AM. В Індії приготування AM повністю залежить від виготовлення поживних середовищ і розчинів власними силами і недоступне у готовому вигляді, як описано в західній літературі.

Амніотична оболонка (amniotic membrane) — це найглибший напівпрозорий шар плодових оболонок (foetal membranes). Вона має аваскулярний стрomальний матрикс (avascular stromal matrix), товстий колагеновий шар (collagen layer) та розташовану зверху базальну мембрану (basement membrane) з одним шаром

Фонд досліджень зору (Vision Research Foundation), Санкара Нетралая (Sankara Nethralaya), Ченнаї, Індія

Запити на передрук надсилати доктору Hajib N Madhavan, Vision Research Foundation, Sankara Nethralaya, 18 College Road, Chennai - 600 006, India. Електронна пошта: drhnm@sankaranethralaya.org

Рукопис отримано: 17.01.2002; Виправлену версію прийнято: 02.06.2002

Кубоподібний епітелій.¹ З 1910 року AM спорадично використовується в клінічній практиці для стимулювання епітелізації при опіках, як трансплантат над шкірними виразками, а також у внутрішньочеревній та реконструктивній хірургії.²AM як трансплантат уперше було використано для реконструкції кон'юнктиви у 1940 році.³ Завдяки стандартизації методики та подальшому розумінню патофізіології, AM рутинно використовується в реконструктивній хірургії очної поверхні з 1995 року.⁴AM можна використовувати або як «субстрат» для заміщення пошкодженої очної тканини, або як «латочку» (біологічну пов'язку), або як комбінацію обох. Захворювання очної поверхні, при яких застосовується трансплантація амніотичної мембрани, включають синдром Стівенса–Джонсона, рубцювання/рубець кон'юнктиви, симблефарон, кон'юнктивохалазис, реконструкцію поверхні кон'юнктиви, заміщення кон'юнктивальних аутотрансплантатів, хірургію птеригіуму, трабекулектомію, хімічну травму, дефіцит лімбальних стовбурових клітин, стійкі епітеліальні дефекти, виразкування рогівки та симптоматичну кератопластику.5-12

Біологічні властивості AM щодо трансплантації

Біологічні властивості та взаємозв'язок цих характеристик детально наведено в таблиці 1. Оскільки в AM виявлено лише неповні антигени HLA, це

імунологічно інертна (immunologically inert) і не відторгається реципієнтом. Завдяки наявності кількох біологічних факторів в амніотичній мембрані (amniotic membrane, AM) при трансплантації на поверхню ока полегшуються епітелізація та загоєння зі зменшеним фіброзом. Присутність у амніотичній мембрані (AM) хемокінів, що пригнічують запалення, зменшує неоваскуляризацію та фіброз під час процесу загоєння.

Приготування та зберігання AM у лабораторії

Плановий кесарів розтин сприяє правильному вибору згідного донора та запланованому збору й обробці АМ. Плацента, зібрана після природних вагінальних пологів, може мати структурні дефекти, пов'язані з розтягненням мембрани під час пологів і народження, а також може бути контамінована нормальною вагінальною флорою, Herpes, Chlamydia або іншими контамінантними бактеріями.²

Для довготривалого збереження тканин використовуваний метод повинен надійно дезінфікувати збережену біологічну тканину. Антибіотична дезінфекція наразі є методом вибору для збереження тканинного матриксу. Безпека щодо передачі вірусів забезпечується відбором донорів і тестуванням на серологічні маркери відомих на цей час трансмісивних вірусів під час донації та повторно через 3-4 місяці.² АМ (amniotic membrane) можна зберігати в гліцеролі, шляхом опромінення, кріоконсервації або ліофілізації. Кріоконсервація при -80°C проводиться з використанням або гліцеролу, або диметилсульфоксиду (DMSO).¹⁶

Для остаточного отримання якісної АМ для трансплантації можна дотримуватися наведених нижче етапів. Етапи підготовки АМ показано на рисунку. Необхідне транспортне середовище, промивні розчини та консервувальне середовище, належним чином перевірені на стерильність, мають бути доступними щонайменше за день до забору та підготовки мембрани. Робочі розчини та середовища слід було приготувати за 7 – 10 днів заздалегідь із повною перевіркою pH та стерильності. Переважно готувати ці розчини за потреби, а не зберігати в морозильній камері за тижні заздалегідь. Підготовку описано нижче.

Таблиця 1. Біологічні властивості амніотичної мембрани людини (АМ) щодо її трансплантації на поверхню ока

Імуногенний характер

Експресія неповних антигенів HLA-A, B та DR¹³Відторгнення AM не відбувається. Епітелій амніотичної оболонки людини не експресує антигени HLA¹⁴Відторгнення AM не відбувається. Трансплантати AM, пересаджені щурам Льюїса, були прийняті; AM є імунологічно привілейованою, але не шкірні трансплантати.¹⁵

Сприяння загоєнню

індукована підвищена експресія фактора IL-1 α та IL-1β, фактора росту кератоцитів, фактора росту гепатоцитів, фактора росту фібробластів, трансформуючих факторів росту (TGF) α та β 18

Рецептор TGFb типу II.¹⁹фібробласти.

Інші механізми

Експресія хемокінів фібробластами та інтерлейкіну 1 пригнічується інгібуванням запалення. Епітеліальні клітини пригнічуються збереженим AM.¹⁷

Протизапальні білки (anti-inflammatory proteins) та інгібітори протеаз (protease inhibitors)¹⁶неоваскуляризація (neovascularization)

Біологічні властивості AM: зв'язок із трансплантаціями

Зниження регуляції сигнального шляху TGF β¹⁶Сприяння антифібротичному ефекту та антирубцевому ефекту.

Стромальний матрикс AM пригнічує ліпополісахарид. Зменшення поверхневого запалення ока, що призводить до зменшення ¹⁷рубцювання та метапластичних змін.

Збережені мРНК експресії людського AM для епідермального росту. Ці фактори відіграють важливу роль в епітелізації та загоєнні.

Збережений AM пригнічує експресію TGF βI, II, III, пригнічення диференціації міобластів у рогівці та лімбі

Пригнічення продукції позаклітинного матриксу (extracellular matrix) та формування рубця цими фібробластами.

Збережена АМ пригнічує сигнальний шлях TGFβ, сприяє міграції та адгезії епітеліальних клітин рогівки і CD-44, β-1 інтегрину та FGFR1/flg птеригіуму²⁰проліферації кератоцитів. АМ діє як «контактна бандажна лінза», що дозволяє епітелізації відбуватися під її покриттям.

Білки в матриксі присутні в консервованій AM⁷Подовження тривалості життя та клоногенності епітеліальних прогеніторних клітин, сприяння диференціації келихоподібних клітин.

Збережена амніотична мембрана (amniotic membrane, AM) має антиангіогенні фактори, пригнічення судинного ендотеліального росту та запобігання

АМ діє як механічний бар'єр¹⁹Виконує функцію анатомічного бар'єра, утримуючи потенційно адгезивні поверхні окремо

• Детальний медичний анамнез і клінічний стан потенційного донора повинні виключати ризик інфекцій, що передаються через тканини, та непридатність донорів.
• Отримують згоду донора на донацію (і подальше використання AM). Донорів скринінгують на інфекції, спричинені вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ) типів 1 і 2, вірусом гепатиту B (HBV), вірусом гепатиту C (HCV) та Treponema pallidum. Ці тести повинні виконувати компетентні лабораторії, а записи слід зберігати протягом 11 років
• після трансплантації. Перегляд записів може стати необхідним, якщо у реципієнта(ів) розвинеться ВІЛ або будь-яка повільна вірусна інфекція, за умови, що вони розвинуться не пізніше ніж через 10 років. Анонімність донора повинна зберігатися.¹⁶
• Також слід отримати згоду на подальший скринінг крові для визначення статусу ВІЛ після «віконного» періоду тривалістю 3-4 місяці.
• AM слід отримувати в стерильних умовах після планового кесаревого розтину.

Етапи підготовки амніотичної мембрани (amniotic membrane, AM) для трансплантації

1. Плаценту разом із затискачем на пуповині поміщають у стерильний посуд. Амніотичну мембрану (AM) відсікають від плаценти на два великі фрагменти. 2. Відсічену AM опускають у стерильний широкогорлий реагентний флакон об'ємом 125 мл із гвинтовою кришкою, що містить транспортне середовище. 3. AM відмивають від згустків крові за допомогою мінімального есенціального середовища Eagle. 4. Будь-які залишки хоріона, прикріплені до AM, та згустки крові обережно відшаровують від епітеліального шару за допомогою пінцета з округлими кінцями. 5. Поверхнею епітеліального/базального шару догори AM рівномірно розправляють без складок і розривів. Стерильну нітроцелюлозну мембрану потрібного розміру накладають на розправлену AM. 6. AM обрізають навколо нітроцелюлозної мембрани та дають їй прикріпитися до неї. 7. Фільтрувальну мембрану разом із прилеглою AM повністю й обережно поміщають у консервувальне середовище в широкогорлих прозорих пластикових флаконах із гвинтовими кришками, що піддані опроміненню. 8. Флакони маркують із зазначенням відповідного розміру та дати приготування. Їх зберігають при -80°C до подальшого використання.

Хімічні речовини

• 1 Мінімальне есенціальне середовище Ігла (EMEM)
• 2 L-глутамін
• 3 Натрію бікарбонат
• 4 Гліцерол

Додаток B. Препарати

• Гентаміцин
• 2 Пеніцилін
• 3 Ципрофлоксацин
• 4 Амфотерицин B

Примітка: для розчинення хімічних речовин і препаратів у потрібних концентраціях слід використовувати деіонізовану воду якості, дистильованої системою Milli Q. Використовувані хімічні речовини та препарати повинні бути ступеня чистоти для культивування тканин від відомих виробників.

• Акушер повинен помістити плаценту в стерильний посуд із нержавіючої сталі діаметром 12 дюймів, бажано накритий стерильною кришкою. Під час розміщення затискач із пуповини не слід знімати, щоб уникнути забруднення амніотичної мембрани (АМ) кров'ю.
• У чистій атмосфері операційної або на чистому ламінарному робочому столі АМ відокремлюють від плаценти на дві великі частини. Якнайбільше хоріона слід відшарувати перед тим, як частини опустити в стерильний широкогорлий реагентний флакон об'ємом 125 мл із гвинтовою кришкою, що містить 50 мл транспортного середовища. Транспортним середовищем, яке зазвичай використовують, є комерційно доступне мінімальне есенціальне середовище Ігла (EMEM) з додаванням 3,3% L-глутаміну та антибіотиків (50 мкг/мл гентаміцину, 100 одиниць/мл пеніциліну, 200 мкг/мл ципрофлоксацину та 1 мг/мл амфотерицину B). Середовища та препарати антибіотиків повинні бути визнаної якості, виготовлені відповідно до стандартів ISO 9002, як це засвідчено компетентним органом із сертифікації. Мембрану необхідно негайно транспортувати до лабораторії.
• У лабораторії під ламінарним витяжним шафою АМ відмивають від згустків крові за допомогою EMEM, що містить антибіотики. Будь-який залишковий хоріон, прикріплений до АМ, та згустки крові обережно відшаровують від шару епітеліальних клітин за допомогою пінцета з круглими кінцями.
• Поверхнею епітеліального/базального шару догори АМ рівномірно розкладають без складок і розривів на індивідуально стерилізованих нітроцелюлозних мембранах розміром 0,22 мкм потрібного розміру (47 мм або 25 мм, комерційно доступні – Millipore або Sartorius). АМ навколо нітроцелюлозної мембрани слід обрізати та дати їй прикріпитися до целюлозної мембрани.

• У разі сумніву невеликий фрагмент мембрани площею близько 1 см² можна дослідити на мікроскопічному скельці під мікроскопом фазового контрасту, щоб визначити епітеліальний бік.
• Фільтрувальну мембрану разом з адгерентною амніотичною мембраною (amniotic membrane, AM) повністю й обережно розміщують у консервувальному середовищі в 50-мл широкогорлих гвинтових опромінених прозорих пластикових флаконах. Використовуване консервувальне середовище — це суміш у співвідношенні 1:1 (об/об) стерильного гліцеролу (стерилізованого в автоклаві) та EMEM з 3,3% L-глутаміну, 25 мкг/мл гентаміцину, 50 одиниць/мл пеніциліну, 100 мкг/мл ципрофлоксацину та 0,5 мг/мл амфотерицину B.
• Флакони маркують із зазначенням відповідного розміру та дати приготування.
• Випадковий флакон із партії залишають на робочому столі за кімнатної температури приблизно на годину, і близько 5 мл його інокулюють у 100 мл середовища «brain heart infusion» та 100 мл тіогліколатного бульйонного середовища для перевірки бактеріальної та грибкової стерильності. Ці середовища інкубують протягом 21 дня, і якщо росту бактерій чи грибів не спостерігається, партію слід вважати законсервованою вільною від культивованих мікробних агентів.
• AM слід зберігати за –80°C для сприяння девіталізації епітеліальних клітин.
• Після підтвердження ВІЛ-негативного статусу донора повторною серологією, проведеною через 3-4 місяці після забору AM, мембрани випускають.
• Мембрани можна використовувати протягом до 6 місяців після приготування. Використання AM протягом 6 місяців рекомендується з таких причин. Встановлено, що клітинна життєздатність знижується більш ніж на 50% протягом двох місяців. 15 Пошкодження клітин AM внаслідок кріоконсервування призводить до зниження пов'язаних з AM рівнів факторів росту. 16,18,21 Як правило, у Токійському медичному університеті клінічно використовують лише кріоконсервовану AM за -80°C, що зберігалася менше 3 місяців. 15
• Мембрану розморожують, тримаючи флакон або за 4°C протягом 30 хвилин, або за кімнатної температури протягом 10 хвилин.
• З підготовленою мембраною слід поводитися належним чином, уникаючи мікробної контамінації під час транспортування до операційної в льоду. Колір середовища для зберігання після розморожування має бути світло-рожевим. Зміна в бік жовтого кольору має розцінюватися як така, що вказує на мікробну контамінацію; будь-яку таку мембрану відбраковують.
• Коли AM відокремлюється від целюлозоацетатної мембрани у флаконі, і хірург не впевнений щодо епітеліального боку AM, його ідентифікують за липкістю до кінчика ватного тампона.

Офтальмологія_Практика.p65 230 8/8/02, 11:00 AM

Наведений вище протокол виявився надзвичайно безпечним, і очікується, що AM, зібрана таким чином, матиме тривалий термін зберігання. Хімікати та препарати, необхідні для приготування AM, наведено в Таблиці 2.

Амніотична мембрана завдяки своїм унікальним властивостям щодо запалення, загоєння та стимулювання епітелізації була дуже корисним біологічним матеріалом для хірургічного лікування деяких захворювань поверхні ока. Її приготування в лабораторії вимагає досвіду в приготуванні середовищ і розчинів та належної лабораторної практики стерилізації й збереження біологічних матеріалів.

Література

• 1. Blanco AA, Pillai CT, Dua HS. Трансплантація амніотичної мембрани для реконструкції поверхні ока. Br J Ophthalmol 1999;83:399-402.
• 2. Adds PJ, Hunt C, Hartley S. Бактеріальне забруднення амніотичної мембрани. Br J Ophthalmol 2001;85:228-30.
• 3. DeRoth A. Пластичне відновлення дефектів кон'юнктиви за допомогою фетальної мембрани. Arch Ophthalmol 1940;23:522-25.
• 4. Kim JCI, Tseng SCG. Трансплантація консервованої людської амніотичної мембрани для реконструкції поверхні при тяжко пошкоджених рогівках кролів. Cornea 1995;14:473-84.
• 5. Tseng SCG, Prabhasawat P, Zee SH. Трансплантація амніотичної мембрани для реконструкції кон'юнктиви. Am J Ophthalmol 1997;124:765-74.
• 6. Prabhasawat P, Barton K, Burkett G, Tseng SCG. Порівняння кон'юнктивальних аутографтів, графтів амніотичної мембрани та первинного закриття при ексцизії птеригіуму. Ophthalmology 1997;104:974-85.
• 7. Tseng SCG, Tsubota K. Трансплантація амніотичної мембрани для реконструкції поверхні ока. У: Holland EJ, Marris M J, редактори. Ocular Surface Diseases: Medical and Surgical Management. New York: springer-Verlag; 2002. p226-31.
• 8. Zee SH, Tseng SCG. Трансплантація амніотичної мембрани при персистентних епітеліальних дефектах з виразкуванням. Am J Ophthalmol 1997;123:303-12.
• 9. Tseng SCG, Prabhasawat P, Barton K, Gray T, Meller D. Трансплантація амніотичної мембрани з або без лімба­льних аутографтів для реконструкції поверхні рогівки у пацієнтів із дефіцитом стовбурових клітин лімба. Arch Ophthalmol 1998;116:431-41.
• 10. Sridhar MS, Bansal AK, Sangwan VS, Rao GN. Трансплантація амніотичної мембрани при гострих хімічних та термічних ушкодженнях. Am J Ophthalmol 2000;130:134-37.
• 11. Meller D, Pires RTF, Mack RJS, Figuiredo F, Heiligenhaus A, Park WC, et al. Трансплантація амніотичної мембрани при гострих хімічних або термічних опіках. Ophthalmology 2000;107:980-90.

• 12. Sridhar MS, Sangwan VA, Bansal AK, Rao GN. Трансплантація амніотичної мембрани в лікуванні щитоподібних виразок весняного кератокон'юнктивіту. Ophthalmology 2001;108:1218-22.
• 13. Akle CA, Adinolfi M, Welsh KI, Leibowitz S, McColl L. Імуногенність епітеліальних клітин амніотичної мембрани людини після трансплантації добровольцям. Lancet 1981;2:1003-5.
• 14. Terada S, Matsuura K, Enosawa S, Miki M, Hoshiki A, Suzuki S, Sakuragawa N. Індукція проліферації епітеліальних клітин амніотичної мембрани людини (HAE) для клітинної терапії. Cell Transplant 2000;9:701-4.
• 15. Kubo M, Sonada Y, Muramatsu R, Usui M. Імуногенність амніотичної мембрани людини в експериментальній ксенотрансплантації. Inves Ophthal Vis Sci 2001;42:1539-46.
• 16. Dua HS, Blanco AA. Трансплантація амніотичної мембрани. Br J Ophthalmol 1999;83:748-52.
• 17. Solomon A, Rosenblatt M, Monray D, Ji Z, Pflugfelder SC, Tseng SCG. Пригнічення інтерлейкіну 1a та інтерлейкіну 1b в епітеліальних клітинах лімба людини, культивованих на стромальному матриксі амніотичної мембрани. Br J Ophthalmol 2001;85:444-49.
• 18. Koizumi N, Inatoni T, Sotozono C, Fullwood N, Quantock A, Kinoshita S. мРНК та білок фактора росту в консервованій амніотичній мембрані людини. Curr Eye Res 2000;20:173-77.
• 19. Hui-Kang D, See LC, Zian SB, Tsai RJF. Трансплантат амніотичної мембрани при первинному птеригіумі: порівняння з автологічним трансплантатом кон'юнктиви та місцевим лікуванням Mitomycin C. Br J Ophthalmol 2000;84:973-78.
• 20. Joussen AM, Kruse FE, Sim B, Baumann J, You L. Морфологія амніотичної мембрани при трансплантації на поверхню ока. 96th DOG Annual Meeting, 1998. p 481.
• 21. Sippel KC, Ma JJK, Foster CS. Хірургія амніотичної мембрани. Curr Opin Ophthalmol 2001;12:269-81.