Вересень 2002 Madhavan et al – Амніотична мембрана для реконструкції очної поверхні 227 Офтальмологічна практика
Приготування амніотичної мембрани (amniotic membrane) для реконструкції поверхні ока (ocular surface)
Hajib N Madhavan, MD, PhD; K Priya, MS, MLT; J Malathi, MS, MLT; Patricia R Joseph, BSc, DMLT
Ми описуємо приготування та збереження амніотичної мембрани людини (human amniotic membrane), необхідної для трансплантації під час лікування захворювань очної поверхні (ocular surface diseases). Отримують інформовану згоду та проводять скринінг донора для виключення ризику трансмісивних інфекцій, таких як вірус імунодефіциту людини (HIV), вірус гепатиту B, вірус гепатиту C та інфекції Treponema pallidum . В ідеалі середовища та промивні розчини (washing solutions), потрібні для приготування амніотичної мембрани, готують лише за тиждень–10 днів до використання і не зберігають у морозильній камері за тижні до цього. Амніотичну мембрану (AM), отриману в стерильних умовах після планового кесаревого розтину (elective caesarian section), відмивають від згустків крові та хоріона (chorion). Епітеліальною поверхнею догори амніотичну мембрану рівномірно розкладають без складок і розривів на окремо стерилізованих нітроцелюлозних мембранах (nitrocellulose membranes) розміром 0,22 µм потрібних розмірів. Підготовлену фільтрувальну мембрану (filter membrane) з прилеглою амніотичною мембраною поміщають у консервувальне середовище (preservative medium) і зберігають при –80°C. Мембрани вивільняють, коли повторна серологія на HIV після вікна періоду (window period) виключила вірусну інфекцію в донора. Залежно від витрати їх можна використовувати до 6 місяців після приготування, хоча багато хто рекомендував зберігання протягом невизначеного періоду. Оскільки амніотична мембрана має лише неповну експресію антигенів HLA, а амніотичні епітеліальні клітини (amniotic epithelial cells) їх не експресують, вона не відторгається після трансплантації. Наявність кількох цитокінів (cytokines) в амніотичній мембрані сприяє епітелізації (epithelialization) зі зменшенням фіброзу (fibrosis) під час загоєння.
Ключові слова: амніотична мембрана, приготування, реконструкція поверхні ока
Indian J Ophthalmol 2002;50:227-31
Протягом останніх кількох років зростає попит на трансплантацію амніотичної мембрани (amniotic membrane, AM) для лікування захворювань очної поверхні. Упродовж останніх двох років ми готували AM у нашій офтальмологічній лікарні третинного рівня для використання офтальмологами. У цьому повідомленні розглянуто біологічні властивості, що становлять основу трансплантації AM, і зроблено спробу надати практичні настанови та необхідне лабораторне обладнання для заготівлі AM. В Індії приготування AM повністю залежить від виготовлення поживних середовищ і розчинів власними силами і недоступне у готовому вигляді, як описано в західній літературі.
Амніотична оболонка (amniotic membrane) — це найглибший напівпрозорий шар плодових оболонок (foetal membranes). Вона має аваскулярний стрomальний матрикс (avascular stromal matrix), товстий колагеновий шар (collagen layer) та розташовану зверху базальну мембрану (basement membrane) з одним шаром
Фонд досліджень зору (Vision Research Foundation), Санкара Нетралая (Sankara Nethralaya), Ченнаї, Індія
Запити на передрук надсилати доктору Hajib N Madhavan, Vision Research Foundation, Sankara Nethralaya, 18 College Road, Chennai - 600 006, India. Електронна пошта: drhnm@sankaranethralaya.org
Рукопис отримано: 17.01.2002; Виправлену версію прийнято: 02.06.2002
Кубоподібний епітелій.1 З 1910 року AM спорадично використовується в клінічній практиці для стимулювання епітелізації при опіках, як трансплантат над шкірними виразками, а також у внутрішньочеревній та реконструктивній хірургії.2AM як трансплантат уперше було використано для реконструкції кон'юнктиви у 1940 році.3 Завдяки стандартизації методики та подальшому розумінню патофізіології, AM рутинно використовується в реконструктивній хірургії очної поверхні з 1995 року.4AM можна використовувати або як «субстрат» для заміщення пошкодженої очної тканини, або як «латочку» (біологічну пов'язку), або як комбінацію обох. Захворювання очної поверхні, при яких застосовується трансплантація амніотичної мембрани, включають синдром Стівенса–Джонсона, рубцювання/рубець кон'юнктиви, симблефарон, кон'юнктивохалазис, реконструкцію поверхні кон'юнктиви, заміщення кон'юнктивальних аутотрансплантатів, хірургію птеригіуму, трабекулектомію, хімічну травму, дефіцит лімбальних стовбурових клітин, стійкі епітеліальні дефекти, виразкування рогівки та симптоматичну кератопластику.5-12
Біологічні властивості AM щодо трансплантації
Біологічні властивості та взаємозв'язок цих характеристик детально наведено в таблиці 1. Оскільки в AM виявлено лише неповні антигени HLA, це
імунологічно інертна (immunologically inert) і не відторгається реципієнтом. Завдяки наявності кількох біологічних факторів в амніотичній мембрані (amniotic membrane, AM) при трансплантації на поверхню ока полегшуються епітелізація та загоєння зі зменшеним фіброзом. Присутність у амніотичній мембрані (AM) хемокінів, що пригнічують запалення, зменшує неоваскуляризацію та фіброз під час процесу загоєння.
Приготування та зберігання AM у лабораторії
Плановий кесарів розтин сприяє правильному вибору згідного донора та запланованому збору й обробці АМ. Плацента, зібрана після природних вагінальних пологів, може мати структурні дефекти, пов'язані з розтягненням мембрани під час пологів і народження, а також може бути контамінована нормальною вагінальною флорою, Herpes, Chlamydia або іншими контамінантними бактеріями.2
Для довготривалого збереження тканин використовуваний метод повинен надійно дезінфікувати збережену біологічну тканину. Антибіотична дезінфекція наразі є методом вибору для збереження тканинного матриксу. Безпека щодо передачі вірусів забезпечується відбором донорів і тестуванням на серологічні маркери відомих на цей час трансмісивних вірусів під час донації та повторно через 3-4 місяці.2 АМ (amniotic membrane) можна зберігати в гліцеролі, шляхом опромінення, кріоконсервації або ліофілізації. Кріоконсервація при -80°C проводиться з використанням або гліцеролу, або диметилсульфоксиду (DMSO).16
Для остаточного отримання якісної АМ для трансплантації можна дотримуватися наведених нижче етапів. Етапи підготовки АМ показано на рисунку. Необхідне транспортне середовище, промивні розчини та консервувальне середовище, належним чином перевірені на стерильність, мають бути доступними щонайменше за день до забору та підготовки мембрани. Робочі розчини та середовища слід було приготувати за 7 – 10 днів заздалегідь із повною перевіркою pH та стерильності. Переважно готувати ці розчини за потреби, а не зберігати в морозильній камері за тижні заздалегідь. Підготовку описано нижче.
Таблиця 1. Біологічні властивості амніотичної мембрани людини (АМ) щодо її трансплантації на поверхню ока
Імуногенний характер
Експресія неповних антигенів HLA-A, B та DR13Відторгнення AM не відбувається. Епітелій амніотичної оболонки людини не експресує антигени HLA14Відторгнення AM не відбувається. Трансплантати AM, пересаджені щурам Льюїса, були прийняті; AM є імунологічно привілейованою, але не шкірні трансплантати.15
Сприяння загоєнню
індукована підвищена експресія фактора IL-1 α та IL-1β, фактора росту кератоцитів, фактора росту гепатоцитів, фактора росту фібробластів, трансформуючих факторів росту (TGF) α та β 18
Рецептор TGFb типу II.19фібробласти.
Інші механізми
Експресія хемокінів фібробластами та інтерлейкіну 1 пригнічується інгібуванням запалення. Епітеліальні клітини пригнічуються збереженим AM.17
Протизапальні білки (anti-inflammatory proteins) та інгібітори протеаз (protease inhibitors)16неоваскуляризація (neovascularization)
Біологічні властивості AM: зв'язок із трансплантаціями
Зниження регуляції сигнального шляху TGF β16Сприяння антифібротичному ефекту та антирубцевому ефекту.
Стромальний матрикс AM пригнічує ліпополісахарид. Зменшення поверхневого запалення ока, що призводить до зменшення 17рубцювання та метапластичних змін.
Збережені мРНК експресії людського AM для епідермального росту. Ці фактори відіграють важливу роль в епітелізації та загоєнні.
Збережений AM пригнічує експресію TGF βI, II, III, пригнічення диференціації міобластів у рогівці та лімбі
Пригнічення продукції позаклітинного матриксу (extracellular matrix) та формування рубця цими фібробластами.
Збережена АМ пригнічує сигнальний шлях TGFβ, сприяє міграції та адгезії епітеліальних клітин рогівки і CD-44, β-1 інтегрину та FGFR1/flg птеригіуму20проліферації кератоцитів. АМ діє як «контактна бандажна лінза», що дозволяє епітелізації відбуватися під її покриттям.
Білки в матриксі присутні в консервованій AM7Подовження тривалості життя та клоногенності епітеліальних прогеніторних клітин, сприяння диференціації келихоподібних клітин.
Збережена амніотична мембрана (amniotic membrane, AM) має антиангіогенні фактори, пригнічення судинного ендотеліального росту та запобігання
АМ діє як механічний бар'єр19Виконує функцію анатомічного бар'єра, утримуючи потенційно адгезивні поверхні окремо
