Вентральний хірургічний доступ для моделі дегенерації та регенерації міжхребцевого диска в шийному відділі хребта вівці: анатомічний технічний опис, переваги та обмеження

Моріц К. Демль¹ Лорін М. Беннекер¹ Таня Шмід² Дайсуке Сакай³ Крістоф Е. Альберс¹ Свен Хоппе¹ Штефан Цайтер²

Адреса для листування: Moritz C. Deml, MD, кафедра ортопедії та травматологічної хірургії (Department for Orthopaedics and Trauma Surgery), Inselspital Bern, Бернський університет (University Bern), Freiburgstrasse 8, 3010 Bern, Швейцарія (електронна пошта: moritz.deml@insel.ch).

Vet Comp Orthop Traumatol 2019;32:389–393.

Анотація Мета Вівці використовуються як модель великих тварин для досліджень міжхребцевого диска. Однак для вентрального хірургічного доступу до шийного диска у овець існує обмежена кількість описів. Тому ми надаємо детальний анатомічний опис цього доступу in vivo у овець для використання в моделях регенерації та дегенерації міжхребцевого диска з метою підвищення відтворюваності таких втручань.

Матеріали та методи. Використано вісімнадцять самок швейцарських білих альпійських овець віком від 2 до 4 років. Виконано вентральний хірургічний доступ для створення визначеного пункційного дефекту міжхребцевого диска (intervertebral disc) на рівнях шийного відділу від C3/4 до C5/6. Рівні шийного відділу C2/3 та C6/7 використано як негативні контролі. Інтраопераційні знахідки, рентгенографічні контролі та післяопераційне клінічне спостереження було задокументовано й зібрано для цього клінічного звіту.

Результати. Усі вівці швидко відновилися після хірургічного втручання. У двох овець розвинулася серома рани (wound seroma), яка розсмокталася спонтанно. Ще у двох овець спостерігалося розходження країв рани (wound dehiscence) протягом 3 днів після операції, що потребувало повторного втручання. Клінічних інфекцій рани не виникало, усі вівці загоїлися добре і не виявляли жодних побічних ефектів, пов'язаних із хірургічною процедурою.

Висновок. Вентральний хірургічний доступ до шийного відділу хребта овець є безпечною та надійною процедурою. Перевагою шийного міжхребцевого диска (cervical intervertebral disc) є легший хірургічний доступ та збільшена висота диска порівняно з поперековим відділом хребта овець. Оскільки шийний міжхребцевий диск овець демонструє високий ступінь подібності (наприклад, молекулярні характеристики) порівняно з людськими дисками, він є перспективною моделлю дегенерації та регенерації для захворювань дисків.

Ключові слова

• ► шийний відділ хребта (cervical spine)
• ► дегенерація міжхребцевого диска (intervertebral disc degeneration)
• ► вівця (sheep)
• ► овечий (ovine)
• ► модель на тваринах (animal model)

Вступ

Вівці широко використовуються як експериментальні моделі в ортопедичних дослідженнях. Вибір відповідної тварини-моделі та методів аналізу скелета є життєво важливими складовими експериментального дизайну та аналізу в дослідженнях дегенерації та регенерації міжхребцевого диска.1–³ Зокрема, описано різні типи овечих моделей поперекового та шийного відділів хребта для заміни диска з подальшим спондилодезом і моделей дегенерації міжхребцевого диска, а також моделей вертебропластики.2–⁸

¹Кафедра ортопедії та травматології, Inselspital Bern, Бернський університет, Берн, Швейцарія

² Науково-дослідний інститут AO в Давосі, Давос, Швейцарія

³Кафедра ортопедичної хірургії, хірургічні науки, Медична школа Університету Токай, Ісехара, Канаґава, Японія

Передній хірургічний доступ до шийного відділу хребта в людей уперше описано Smith і Robinson у 1958 році.⁹ Сьогодні передній хірургічний доступ до шийного відділу хребта в людей і вентральний доступ до цієї ділянки в собак є стандартними хірургічними процедурами.¹⁰ Завдяки схожості анатомії шийного відділу хребта овець і людей його також можна використовувати на овечих зразках.11–¹³

Існують поодинокі описи вентральних хірургічних доступів до шийного відділу хребта овець, як описано Allen та колегами.¹⁴ Однак, наскільки нам відомо, дотепер немає детального опису вентрального відкритого доступу до шийного відділу хребта у моделі вівці для аналізу дегенерації та регенерації міжхребцевих дисків.¹⁴ Наразі відтворюваність доклінічних досліджень є предметом обговорення, і детальний, стандартизований опис хірургічних моделей підвищить строгість майбутніх досліджень.² Тому ми надаємо детальний опис анатомічних орієнтирів для вентрального хірургічного доступу до шийного відділу хребта вівці, щоб нанести заздалегідь визначений вентральний дефект диска для провокування дегенерації міжхребцевого диска та для тестування різних регенеративних агентів. Ми також надаємо детальну інформацію про ветеринарний догляд до та після операції, необхідний для належного відновлення тварини.

Матеріали та методи

Тварини

Для дослідження використано 18 молодих дорослих самок швейцарської білої альпійської вівці віком від 2 до 4 років із середньою (стандартним відхиленням) масою тіла 72,8 (11,7) кг. Тварини, залучені до дослідження, були здоровими та вільними від ортопедичних захворювань (на підставі передопераційного клінічного огляду ветеринаром, підрахунку лейкоцитів, загального білка, рентгенограм та комп'ютерної томографії ділянки операції). Тварин утримували в стайнях Дослідницького інституту AO у Давосі (Давос, Швейцарія). Тварини проходили акліматизацію щонайменше 2 тижні та отримували корм двічі на день у вигляді силосу, сіна та соломи з постійним вільним доступом до води. Установа акредитована AAALAC, а також сертифікована за GLP та ISO 9001:2008. Дослідження виконано відповідно до Закону Швейцарії про захист тварин за ліцензією № 40_2014 та 21E_2015 від кантональних органів влади Граубюндена, Швейцарія.

Хірургічний доступ

З дня перед операцією їжу не давали, але вівці мали необмежений доступ до води. Їх седатували 0,5 мг/кг детомідину внутрішньом'язово (в/м) у стайні, анестезію індукували 0,2 мг/кг діазепаму в суміші з 3–4 мг/кг кетаміну внутрішньовенно та підтримували севофлураном (1,2–2,2% об/об у 0,6–1 л кисню). Передопераційно внутрішньовенно вводили 2,2 мг цефтіофуру та 1,4 мг/кг карпрофену. Вівці були розміщені в дорсальному положенні (dorsal recumbency), шию виголили. Для підтримання шийного лордозу (cervical lordosis) ми використовували підкладку під шиєю для досягнення розширення шийних міжхребцевих просторів (cervical disc spaces). Шкіру асептично підготували до операції шляхом втирання мила з хлоргексидином протягом щонайменше 2 хвилин з подальшим обмиванням спиртом.

Рис. 1 Вигляд хірургічного поля на вентральній поверхні шиї вівці після вистригання, асептичної підготовки та обкладання.

(►Fig. 1). Після хірургічного обкладання стерильною білизною виконано шкірний розріз довжиною від 15 до 20 см поздовжньо до шиї по вентральному краю грудинно-ключично-соскоподібного м'яза (musculus sternocleidomastoideus) (►Fig. 2). Виконано препарування шляхом тупого розділення між трахеєю та стравоходом (медіально) і каротидним піхвою (латерально), з використанням електрокоагуляції для гемостазу за потреби (►Fig. 3). Оголено вентральну поверхню шийного відділу хребта від C2 до C7, яка майже повністю вкрита V-подібними довгими м'язами шиї (longus colli), які є більш вираженими, ніж у людей, і беруть початок із середини вентральної частини хребців (►Figs. 4 and 5). Латеральну та фронтальну візуалізацію виконано з використанням стандартної C-дуги. Обрані диски оголено шляхом дуже обережного та тупого розділення для запобігання пошкодженню замикальних пластинок та інших структур (►Fig. 6). У всіх овець оголено рівні C3/4 до C5/6 та нанесено дефект пуансоном. Після оголення вентральної частини обраного міжхребцевого диска та розсічення початку довгого м'яза шиї (longus colli) краніально до міжхребцевого диска введено 1-мм дріт Кіршнера в диск для підтвердження правильного положення та напрямку для створення дефекту знову за допомогою радіологічної візуалізації у двох площинах. Це гарантує відсутність пошкодження замикальних пластинок сусідніх хребців та розташування дефекту диска в однаковому положенні в усіх міжхребцевих дисках (►Fig. 7). Потім ми створили дефект діаметром 2 мм та

Рис. 2 Анатомічний ситус (situs) після поздовжнього розрізу шкіри.

Рис. 3 Анатомічний situs (situs) після глибшого тупого препарування.

Рис. 6. Підготовлений вентральний аспект міжхребцевого диска (intervertebral disc) між суміжними хребцями та сухожилками довгих м'язів шиї (longus colli muscles).

Рис. 4 Анатомічне розташування (situs) з характерною V-подібною формою довгих м'язів шиї (longus colli muscles).

Рис. 7 Маркування міжхребцевого диска (intervertebral disc) 1-мм шпицею Кіршнера (Kirschner wire pin) з контролем за допомогою електронно-оптичного перетворювача (image intensifier).

Рис. 5. Характерна V-подібна форма довгих м'язів шиї (longus colli muscles) вентрально від міжхребцевого диска (intervertebral disc), які є більш вираженими, ніж у людей, і беруть початок безпосередньо посередині хребців на кожному рівні.

Рис. 8 Створення дефекту міжхребцевого диска (intervertebral disc) пуансоном 2 4 мм.

Дефект круглої форми глибиною 4 мм за допомогою попередньо визначеного пробійника відповідного розміру (►Fig. 8). Дефект виконували посередині вентральної сторони фіброзного кільця (annulus fibrosus), щоб не пошкодити кісткові замикальні пластинки (bone endplates) суміжних хребців (►Fig. 9). Після створення дефекту можна застосувати метод відновлення або залишити його порожнім як негативний контроль. Глибину дефекту контролювали шляхом вимірювання довжини вилученого матеріалу диска з пробійника. Вона становила від 3,8 до 4,2 мм у всіх випадках. Закриття рани виконували у три шари: фасція, підшкірна тканина та внутрішньошкірний шов шкіри, використовуючи безперервний адаптувальний взірець (continuous adapting pattern) та розсмоктувальний шовний матеріал (Monocryl metric 2, Ethicon). Було накладено стент і шийну пов'язку з м'яким обгортанням, які зняли через 3 дні. Дренаж не застосовували.

Рис. 9 Матеріал дефекту міжхребцевого диска (intervertebral disc) перед пробійником (punch) після формування дефекту пробійником та екструзії матеріалу міжхребцевого диска (intervertebral disc).

Післяопераційний догляд складався з 2,2 мг/кг цефтіофуру підшкірно (п/ш) один раз на добу та 1,4 мг/кг карпрофену п/ш. Його повторювали через 72 години з огляду на період напіввиведення з плазми 70 годин для забезпечення покриття загалом протягом 6 днів. Додатково на передню кінцівку накладали фентаніловий пластир (2 мкм/кг/год) на 3 дні. Щоб забезпечити належне всмоктування фентанілу для досягнення аналгетичного рівня протягом перших 24 годин, застосовували 0,05 мг/кг бупренорфіну внутрішньом'язово (в/м) кожні 8 годин. Вівці утримували групами по дві протягом перших 2 тижнів. Після повного загоєння ран їх утримували більшими групами. Добробут тварин оцінювали за допомогою внутрішнього оціночного листа досвідчений доглядач тварин або ветеринар. Оцінювали та виставляли бали за такими параметрами: загальна поведінка та зовнішній вигляд, дихання, споживання їжі та води, положення тіла (з акцентом на спині), температура, загоєння ран, маса тіла та фекалії. Залежно від балів вживали заздалегідь визначених заходів, наприклад, клінічний огляд ветеринаром або виключення з дослідження. Масу тіла реєстрували через 2 та 4 тижні після операції, а згодом щомісяця.

Результати

У двох овець спостерігалося утворення сероми (seroma) в ділянці розрізу, яка розсмокталася без додаткового втручання. У двох інших овець сталася розходження країв рани (wound dehiscence) протягом перших 3 днів після операції. В обох овець було проведено ревізію рани (wound revision) з повторним первинним закриттям. Інтраопераційно чітких ознак інфекції, таких як гній, не спостерігалося. Тим не менш, через підвищений ризик інфекції антибіотикотерапію було продовжено до 2 тижнів у цих чотирьох овець. Пізніше жодних інфекцій рани не виявлено. Згодом усі вівці одужали після операції без ускладнень. Крововтрата була незначною (^< 20 мл) в усіх тварин у нашому дослідженні.

В іншому жодна з вівцематок не виявляла жодних клінічних проблем — ні в поведінці, ні в ознаках болю, ні в положенні голови, ні в ковтанні, ні в неврологічних порушеннях — протягом періоду дослідження, що становив або 3 місяці (вісім вівцематок), або 1 рік (десять вівцематок). Гістологічне та візуалізаційне обстеження із застосуванням сканування методом магнітно-резонансної томографії та комп'ютерної томографії показало належним чином розташований дефект у всіх зразках. Ці результати нещодавно були опубліковані Zhou та колегами.¹⁵

Обговорення

Дейлі та колеги порівняли широкий спектр моделей тварин для дослідження дегенерації міжхребцевого диска.² Автори рекомендували вівцю як модель регенерації міжхребцевого диска. По-перше, тому що вони також страждають від втрати клітин хорди в ранньому дорослому віці, що схиляє міжхребцевий диск вівці до дегенерації, подібної до людських дисків.¹⁶ Однак дегенерація міжхребцевого диска у овець потребує часу, має низьку захворюваність і велику варіабельність, а отже, є непередбачуваною. Для надійних доклінічних досліджень необхідно мати відтворювану модель дегенерації диска. Ще однією перевагою вівці є те, що вони мають приблизно подібний до людини розмір, демонструють подібні показники метаболізму і, незважаючи на чотириногий спосіб пересування, їхні міжхребцеві диски зазнають дуже подібних механічних навантажень, як і людський міжхребцевий диск.11,17 Тому хребет вівці використовувався як модель для дегенерації міжхребцевого диска та випробування імплантатів, а також у доклінічних дослідженнях клітинних терапій.7,11,18–²⁰ Аналізи біомеханіки шийного відділу хребта вівці та параметрів радіологічної анатомії підтвердили високу подібність до показників шийного відділу хребта людини, що дозволяє використовувати імплантати та інструменти аналогічного розміру, як і в клінічних умовах у людини.11,17 Порівняно з шийним відділом хребта людини, диск вівці навіть вищий за верхньо-нижніми розмірами, що, відповідно до переважно безсудинної природи міжхребцевого диска та залежності від дифузії для забезпечення поживних потреб, видається сприятливим для амбітної моделі регенерації диска.11,20 Більша висота міжхребцевих дисків також робить більш здійсненним нанесення належного дефекту міжхребцевого диска без пошкодження замикальних пластинок сусідніх хребців, що є перевагою порівняно з поперековими дисками вівці, які тонші за шийні міжхребцеві диски.¹³ Тим не менш, з нашого досвіду, ми рекомендуємо використовувати інтраопераційну рентгенографічну C-дугову візуалізацію в обох площинах для підтвердження правильного положення дефекту та гарантії відсутності пошкодження замикальних пластинок сусідніх хребців. Крім того, з нашої точки зору, порівняно з поперековим вентральним заочеревинним доступом, доступ до вентрального шийного відділу хребта технічно легший у виконанні.⁸ Він також, схоже, поєднується з меншими хірургічними ризиками, особливо щодо судинних та внутрішньочеревних уражень.²¹ У нашій серії проблеми з ковтанням, годуванням або питтям у безпосередньому або пізньому післяопераційному періоді не спостерігалися.

Хоча хірургічне втручання в цій когорті овець переносилося добре, у двох овець після операції спостерігалося розходження країв рани, яке потребувало повторного втручання. У двох інших спостерігалася серома без потреби в повторному втручанні. Ця частота проблем із раною є порівнянною з раніше опублікованими даними.¹² Особливу увагу слід приділяти адекватному закриттю рани та фіксованим пов'язкам для запобігання проблемам із раною. І важливо дуже ретельно спостерігати за тваринами в післяопераційному періоді, щоб мати змогу реагувати у разі виникнення таких ускладнень, як розходження країв рани.

Незважаючи на те, що існує багато спільних рис у процесах регенерації та дегенерації диска, між міжхребцевим диском людини та вівці, звичайно ж, є біомеханічні та біологічні відмінності.¹³ Чи є це важливим для індивідуального процесу дегенерації та регенерації диска, дотепер не з'ясовано. Подальшим обмеженням є стандартний перфораційний дефект (set punch defect) у попередньо здоровому диску, що оминає «природний» процес дегенерації. У цьому випадку слід очікувати вищого потенціалу регенерації порівняно з людьми з наявними дегенеративними станами.²²

Висновок

Раніше були описані моделі дисків овець для аналізу процесів дегенерації та преклінічних терапій регенерації.5,20 Більшість із цих моделей використовують поперековий відділ хребта овець. Окрім того факту, що вівці є однією з найбільш ідеальних моделей дисків, зазначених Daly та колегами дотепер, існує лише обмежена кількість даних щодо моделей дегенерації та регенерації дисків у шийному відділі хребта овець.² Хірургічний доступ до вентрального шийного відділу хребта овець має високу схожість із таким у людей і, з урахуванням анатомічних відмінностей, може виконуватися хірургами хребта або ветеринарами. Анатомія, біомеханічні та біологічні характеристики шийного відділу хребта овець і міжхребцевого диска (intervertebral disc) є порівнянними з такими у людей лише з небагатьма обмеженнями.¹³ Модель міжхребцевого диска (intervertebral disc) вівці у шийному відділі хребта в поєднанні з описаним вентральним доступом видається перспективною тваринною моделлю для преклінічних досліджень терапій дегенерації та регенерації дисків.

Авторський внесок

Moritz C. Deml та Lorin M. Benneker долучилися до концепції дослідження, дизайну дослідження, збору даних, аналізу та інтерпретації даних. Stephan Zeiter, Tanja Schmid та Daisuke Sakai долучилися до концепції дослідження, дизайну дослідження та збору даних. Christoph E. Albers та Sven Hoppe долучилися до аналізу та інтерпретації даних. Moritz C. Deml, Stephan Zeiter, Christoph E. Albers, Sven Hoppe та Tanja Schmid підготували та відредагували рукопис. Усі автори схвалили подану рукопис.

Розкриття інформації

Автори не отримують компенсації, і немає жодних інших інституційних субсидій, корпоративних афіліацій або джерел фінансування, що підтримують цю роботу, якщо це чітко не задокументовано та не розкрито. Цей проєкт було виконано в Дослідницькому інституті AO Davos, Давос, Швейцарія.

Фінансування

Це дослідження було профінансовано Спільною дослідницькою програмою з відновлення фіброзного кільця (Annulus Fibrosus Repair) Фонду AO (AO Foundation). Усі автори цієї статті є дослідницькими партнерами Спільної дослідницької програми з відновлення фіброзного кільця (Annulus Fibrosus Repair) Фонду AO (AO Foundation).

Конфлікт інтересів: не заявлено.

Подяки

Ми щиро вдячні членам Дослідницького інституту AO в Давосі за їхню невтомну підтримку.

Література

• 1 Remick D. Використання моделей тварин для дослідження захворювань людини — дискусія Товариства шоку. Shock 2013;40(04):345–346
• 2 Daly C, Ghosh P, Jenkin G, Oehme D, Goldschlager T. Огляд моделей тварин дегенерації міжхребцевого диска: патофізіологія, регенерація та трансляція в клініку. BioMed Res Int 2016;2016:5952165
• 3 Kitchen H. Вівці як моделі тварин у біомедичних дослідженнях. J Am Vet Med Assoc 1977;170(06):615–619
• 4 Benneker LM, Gisep A, Krebs J, Boger A, Heini PF, Boner V. Розробка експериментальної моделі in vivo для черезшкірної вертебропластики у овець. Vet Comp Orthop Traumatol 2012;25(03):173–177
• 5 Oehme D, Ghosh P, Shimmon S, et al. Мезенхімальні прогеніторні клітини в комбінації з пентозан полісульфатом, що опосередковують регенерацію диска під час мікродискектомії: попереднє дослідження на овечій моделі. J Neurosurg Spine 2014;20(06):657–669
• 6 Fazzalari NL, Costi JJ, Hearn TC, et al. Механічні та патологічні наслідки індукованих концентричних розривів фіброзного кільця на овечій моделі. Spine 2001;26(23):2575–2581
• 7 Osti OL, Vernon-Roberts B, Fraser RD. Премія Volvo 1990 в експериментальних дослідженнях. Розриви фіброзного кільця (anulus) та дегенерація міжхребцевого диска. Експериментальне дослідження з використанням моделі тварини. Spine 1990;15(08):762–767
• 8 Baramki HG, Papin P, Steffen T. Хірургічний доступ до вентральної поверхні поперекових хребців на овечій моделі. Surg Radiol Anat 2000;22(01):25–27
• 9 Smith GW, Robinson RA. Лікування деяких розладів шийного відділу хребта шляхом переднього видалення міжхребцевого диска та міжтілового зрощення. J Bone Joint Surg Am 1958;40-A(03):607–624
• 10 Johnson KA. Атлас хірургічних доступів до кісток і суглобів собаки та кота за П'єрматтеї. 5-те вид. St Louis Missouri: Elsevier; 2014:56–63
• 11 Kandziora F, Pflugmacher R, Scholz M, et al. Порівняння шийних відділів хребта вівці та людини: анатомічне, рентгенографічне дослідження, дослідження мінеральної щільності кістки та біомеханічне дослідження. Spine 2001;26(09):1028–1037
• 12 Goldschlager T, Rosenfeld JV, Young IR, Jenkin G. Передня шийна дискектомія та зрощення на овечій моделі. J Vis Exp 2009;(32):1548
• 13 Wilke HJ, Kettler A, Wenger KH, Claes LE. Анатомія хребта вівці та її порівняння з хребтом людини. Anat Rec 1997;247(04):542–555
• 14 Allen MJ, Hai Y, Ordway NR, Park CK, Bai B, Yuan HA. Оцінка синтетичної передньої шийної зв'язки (anterior cervical ligament) на моделі спондилодезу у овець. Spine J 2002;2(04):261–266
• 15 Zhou Z, Zeiter S, Schmid T, et al. Вплив фібринового гелю, що вивільняє CCL5, на регенерацію міжхребцевого диска. Cartilage 2018. doi:
• 16 Hunter CJ, Matyas JR, Duncan NA. Цитоморфологія нотохордальних та хондроцитарних клітин з драглистого ядра (nucleus pulposus): порівняння видів. J Anat 2004;205(05):357–362
• 17 Wilke HJ, Kettler A, Claes LE. Чи є хребти овець валідною біомеханічною моделлю для хребтів людини? Spine 1997;22(20):2365–2374
• 18 Melrose J, Shu C, Young C, et al. Механічна дестабілізація, індукована контрольованим надрізом фіброзного кільця (anulus) міжхребцевого диска, порушує регуляцію експресії металопротеїназ та індукує дегенерацію диска. Spine 2012;37(01):18–25
• 19 Fagan AB, Sarvestani G, Moore RJ, Fraser RD, Vernon-Roberts B, Blumbergs PC. Іннервація розривів фіброзного кільця (anulus): експериментальне дослідження на тваринах. Spine 2010;35(12):1200–1205
• 20 Oehme D, Ghosh P, Goldschlager T, et al. Відновлення дегенерованих поперекових дисків овець за допомогою STRO-3-позитивних алогенних мезенхімальних прогеніторних клітин у комбінації з пентозан полісульфатом. J Neurosurg Spine 2016;24(05):715–726
• 21 Kang BU, Choi WC, Lee SH, et al. Аналіз ускладнень, пов'язаних із загальною хірургією, у серії з 412 мінілапаротомічних передніх попереково-крижових процедур. J Neurosurg Spine 2009;10(01):60–65
• 22 Alini M, Eisenstein SM, Ito K, et al. Чи є моделі тварин корисними для вивчення розладів/дегенерації дисків людини? Eur Spine J 2008;17(01):2–19