1. Introduction
Північно-західна Іспанія є важливим районом скотарства. Хоча молочна промисловість становить основну економічну діяльність аграрного сектору, інші види, такі як вівці та кози, відіграють значну роль у сталості сільських громад (економічне забезпечення та рентабельність місцевих ферм). Дрібні жуйні тварини дозволяють використовувати недостатньо задіяні ґрунти для випасання худоби, закріплюючи населення в сільській місцевості та контролюючи біомасу та пожежі в лісах, що запобігає деградації довкілля. У Галісії налічується 21 709 отар дрібних жуйних тварин із середнім поголів'ям 10,6 тварин, а козівництво завжди було тісно пов'язане з вівчарством; змішані вівце-козячі отари становлять 12,3% ферм дрібних жуйних, але включають 24,6% поголів'я овець у Галісії (45 627 із 185 236) та майже половину кіз (21 873 із 44 049) [1].
Спільне утримання овець і кіз досі не розглядалося як фактор ризику зараження паразитами, хоча обидва види поділяють багатьох спільних паразитів. Попереднє дослідження хронічних респіраторних захворювань овець показало, що контакт із козами, навіть на низькому рівні, становив фактор ризику для протостронгільозних інфекцій у овець [2]; однак інформація про інші паразитарні інфекції відсутня. Розгляд змішаного утримання з козами як фактора ризику для інфікування овець також виявлено при вірусних інфекціях; високий рівень контакту між вівцями та козами був показаний як фактор ризику для вірусу вісни-маеді (Visna-Maedi virus, VMV), навіть у отарах із невеликою кількістю кіз [3].
Основною метою цього дослідження було встановити, чи є змішане утримання овець і кіз фактором ризику для основних травних і респіраторних паразитарних інфекцій овець.
2. Матеріали та методи
2.1. Заява про схвалення етики
Усі зразки фекалій, використані в цьому дослідженні, були зібрані з дозволу власників ферм. Усі експериментальні процедури повністю відповідали європейським та іспанським етичним нормам щодо захисту тварин, які використовуються в наукових цілях (Європейська директива 2010/63/ЄС та Іспанський королівський указ 53/2013), і були схвалені етичним комітетом Університету Сантьяго-де-Компостела.
2.2. Тварини та обстежені отари
Дослідження проводилося в Галісії, на північному заході Іспанії (41°49′–43°47′ пн. ш., 6°42′–9°18′ зх. д.), охоплюючи територію площею 29 574 км², з м'якими річними температурами (13–14 °C) та помірною річною кількістю опадів (1300–1500 мм).
У Галісії дрібні жуйні тварини утримуються переважно в напівекстенсивній системі господарювання, з пасовищами поблизу хліва, де їх тримають на ніч, і всі господарства застосовували антигельмінтне лікування для контролю шлунково-кишкових нематод. Загалом було зібрано 2093 зразки овечих фекалій із 74 комерційних м'ясних овечих стад (Рисунок 1); 58 були чисто овечими стадами (1625 овець), а 16 — змішаними стадами овець і кіз (468 овець). У останніх також було відібрано зразки від 25% кіз (103 кози).
Усі тварини були безпородними та старшими за 6 місяців; відібрані стада були розподілені по всій території регіону. Відібрані тварини не отримували антигельмінтного лікування з моменту попередньої кампанії, тобто тварин відбирали щонайменше через два місяці після останнього лікування.
2.3. Дослідження фекальних проб
Зразки фекалій відбирали безпосередньо з прямої кишки у пластикових рукавичках і зберігали при 4 °C до аналізу того ж дня різними копрологічними методами (флотація, седиментація та міграція). Коротко, для методу міграції за Берманом–Ветцелем [4,5] для виявлення личинок протостронгілід (переважно Muellerius capillaris, але у чотирьох овець — Neostrongylus linearis) та Dictyocaulus filaria, 10 г фекалій залишали на ніч з нетканими фільтрами (Filter-Lab, Filtros Anoia, S.A., Барселона, Іспанія) у скляних лійках із центрифужною пробіркою об'ємом 12 мл на кінці силіконової трубки. Пробірки центрифугували 10 хв при 350× g, а популяцію личинок зберігали в останньому мілілітрі для аналізу в камерах Фаваті. Ці камери з метакрилату мають комірку розміром 24 × 24 × 3 мм, що дозволяє мікроскопічне спостереження об'єму, отриманого після центрифугування; комірка містить постійну сітку, яка дозволяє користувачеві підраховувати точніше. Для шлунково-кишкових нематод (яйця типу стронгілід — GIN), яєць цестод та ооцист Eimeria використовували метод флотації (модифікований метод МакМастера) [6]. Спочатку 3 г фекалій зважували та додавали до 42 мл води та скляних кульок (діаметром 6 мм) для ретельного перемішування вмісту. Цей матеріал потім фільтрували через сито 150 мкм (CISA Sieving Technologies, Барселона) у дві скляні пробірки, які заповнювали фекальною суспензією. Пробірки центрифугували при 500× g протягом 5 хв, а супернатант видаляли. Потім пробірки заповнювали насиченим розчином NaCl для флотації (SG 1.19 при 20 °C), а осад обережно перемішували. Паразитарні форми підраховували в камері МакМастера; кількість яєць на грам фекалій отримують множенням загальної кількості яєць у двох квадратах на 50 (3 г фекалій дають 45 мл суспензії, а досліджували 0,3 мл) [6]. Яйця трематод (Fasciola hepatica, Paramphistomidae та Dicrocoelium dendriticum) виявляли методом седиментації. Фекалії зважували (3 г) у пластиковий контейнер із 40–50 мл водопровідної води та скляними кульками. Розчин ретельно перемішували та фільтрували через сито 150 мкм у пластикову склянку, промиваючи сито, доки в конічну склянку не потрапляв 1 л. Суміш осаджували протягом 20 хв, а супернатант дуже обережно видаляли до залишку 200 мл. Ці 200 мл ресуспендували до 500 мл і давали осісти ще 20 хв. Супернатант знову видаляли до 50 мл, ресуспендували до 100 мл і давали осісти ще 20 хв, а супернатант видаляли до залишку 50 мл. Нарешті, останні 50 мл перемішували, і аліквоту спостерігали на дні камери МакМастера.
Морфологічні діагностичні методики виконувалися у строгій послідовності: спочатку фекалії зважували для міграції, потім для флотації і нарешті для седиментації, тому було проведено 2093 міграційних, 1914 флотаційних та 1697 седиментаційних тестів, відповідно до наявних фекалій.
2.4. Статистичний аналіз
Зв'язки між контактом вівці–кози та поширеністю паразитарних інфекцій вивчали індивідуально за допомогою критерію хі-квадрат, із використанням функції cc(), включеної в пакет epiDisplay [7,8] у статистичному програмному забезпеченні R (R v.3.5.3) [9]. Функція cc() обчислює відношення шансів, розраховане точним методом, 95% довірчий інтервал, критерій хі-квадрат і точний критерій Фішера. Потім для побудови багатовимірного підходу до аналізу використовували моделювання структурними рівняннями методом часткових найменших квадратів [10]. PLS-PM може обробляти конструкції з одним та кількома показниками, що дозволяє досліджувати зв'язки між змінними паразитарних інфекцій та контактом вівці–кози (з використанням функції plspm() у пакеті plspm) [10].
Для дослідження інтенсивності інвазії застосовували непараметричний критерій Вілкоксона (Wilcoxon rank test) для позитивних овець залежно від того, чи контактували вони з козами, враховуючи, що показники кількості паразитарних форм у фекаліях не є нормальними (функція shapiro.test(), R v.3.5.3) [9].
3. Результати
3.1. Поширеність та інтенсивність інвазії у овець і кіз
Таблиця 1 демонструє загальну поширеність та інтенсивність інвазії для овець і кіз, включених у це дослідження. Кокцидії були найпоширенішими паразитами для обох видів, за якими слідували шлунково-кишкові нематоди (GIN) у овець та протостронгіліди у кіз. Кози демонстрували вищу поширеність інвазії протостронгілідами, D. filaria, GIN та Eimeria spp., ніж вівці, а також вищі показники виділення, за винятком D. filaria; це було особливо актуально для протостронгілідів, відсоток яких був у шість разів вищим у кіз, ніж у овець. Жодна коза не була позитивною на інвазію трематодами або Moniezia; ці паразити були присутні лише у овець із дуже низькою поширеністю.
3.2. Вплив контакту овець і кіз на поширеність паразитів
Індивідуальні показники поширеності різних паразитарних інфекцій у овець у чистих та змішаних отарах наведені в Таблиці 2.
Загалом, поширеність різних паразитів була вищою у змішаних отарах, ніж у чистих овечих. Тест хі-квадрат показав, що контакт із козами був фактором ризику зараження овець протостронгілідами, D. filaria, шлунково-кишковими нематодами (GIN) та Eimeria spp. (p < 0,001) у всіх випадках. Для цих інфекцій поширеність була у 1,61–1,99 раза вищою в овець зі змішаних отар, ніж у овець із чистих отар. З іншого боку, поширеність Moniezia, F. hepatica, D. dendriticum та Paramphistomidae не залежала від контакту з козами. Багатофакторний аналіз показав ті самі асоціації, що й однофакторний тест хі-квадрат; кореляції, отримані за допомогою функції plspf(), між змінними інфекції та контактом вівці–кози, відображені на рисунку 2. За ступенем зв'язку найбільш ураженою інфекцією була кокцидіоз, за яким слідували GIN, протостронгіліди та D. filaria серед значуще пов'язаних. Хоча значення R були низькими, інфекції також корелювали між собою, головним чином GIN та D. filaria (дані не показані), а ефект змішаного утримання є лише однією зі змінних ризику для інфекцій овець.
3.3. Інтенсивність інфекції та вплив контакту з козами
Показники паразитарного навантаження у овець наведено в Таблиці 3. Тест Вілкоксона показав відмінності між двома групами лише за інфекцією протостронгілідами (15,9 личинок на грам фекалій — lpg — у групі контакту з козами проти 9,8 lpg у чистих овечих отарах) та Paramphistomidae (168,3 яєць на грам — epg — у групі контакту з козами проти 62,8 epg у чистих овечих отарах). У випадку Paramphistomidae результати слід інтерпретувати з обережністю, оскільки позитивними були лише три тварини, що контактували з козами, та дев'ять — у чистих отарах.
4. Обговорення
У цьому дослідженні найпоширенішими паразитами як у овець, так і у кіз, за напівекстенсивної системи утримання, були кокцидії, шлунково-кишкові нематоди (GIN) та легеневі гельмінти. Для всіх цих паразитів поширеність та інтенсивність інвазії були вищими у кіз, ніж у овець; ці відмінності були особливо суттєвими для протостронгілід. Інші попередні дослідження виявили вищу поширеність [11,12] та інтенсивність виділення личинок [11,13] у кіз порівняно з вівцями. Така ж ситуація спостерігалася щодо інвазії шлунково-кишковими нематодами (GIN), як при експериментальних [13,14,15], так і при природних інфекціях [16]. На противагу цьому, хоча і в невеликій кількості, цестоди та трематоди були виявлені лише у овець.
Наші результати показують, що спільне утримання овець і кіз можна розглядати як фактор ризику для деяких найпоширеніших паразитарних інфекцій у дрібних жуйних. Слід розглянути дві ситуації. Перша стосується неспецифічних паразитів, тобто паразитів, спільних для овець і кіз, таких як легеневі гельмінти та шлунково-кишкові нематоди (GIN); трематодні інфекції та інфекції, спричинені Moniezia, можна виключити, оскільки не було кіз, інфікованих цими паразитами. Можливим поясненням може бути те, що порівняно з вівцями кози, схоже, розвивають слабку імунну відповідь проти паразитичних нематод. Через їхній «кущовий» тип живлення (browser) кози, порівняно з вівцями, розвинули низьку здатність формувати імунну відповідь на нематод. Це може пояснити, чому в умовах випасання кози не розвивають резистентність до шлунково-кишкових нематод (GIN) так ефективно, як вівці [17]. За такої ситуації легко пояснити вплив кіз як фактора ризику для овець за спільного утримання, оскільки кози функціонують як джерело забруднення пасовищ [13], а також забруднюють годівниці, напувалки та підстилку.
Це пояснення не є валідним для видоспецифічних паразитів, як у випадку Eimeria spp., які рідко передаються від одного виду хазяїна до іншого [18]; насправді, експерименти з перехресного зараження між вівцями та козами були безуспішними [19]. Отже, хоча в деяких випадках кози можуть виділяти значно більшу кількість ооцист, ніж вівці [20], це не може вважатися джерелом інфекції ооцистами для овець. Одним із пояснень ефекту змішаного утримання, навіть якщо види паразитів різні, може бути те, що кози, як правило, займають кормові ділянки з меншим паразитарним навантаженням; вівці є травоїдними тваринами, що пасуться на траві, і схильні випасати високоякісні частини рослин, тоді як кози, як активні фуражири, схильні обирати високоперетравлювані частини трав, але також споживають деревні або стеблові корми та поїдають квіти, плоди й листя, з меншою кількістю паразитарних форм, ніж вівці [21], і відмовляються від води з фекальним забрудненням або вологого корму із запахом плісняви [22]. Кози також мають сильну ієрархічну структуру, яка підтримується бійками [22]. Легко припустити, що рогаті кози домінують над вівцями, визначаючи кормові ділянки. Чиста отара може використовувати всю територію для випасу, але змішана отара може означати зменшену територію для овець, що спричиняє ще більше забруднення через концентрацію. Крім того, ситуація конкуренції за їжу, безумовно, є стресовою, і стрес відіграє роль у сприйнятливості ягнят до кокцидіозу, а також до гострого кокцидіозу у дорослих тварин, які зазнали стресу [23].
5. Висновки
Це дослідження головним чином показує, що змішані отари овець і кіз є фактором ризику, який сприяє паразитуванню овець; поширеність і, меншою мірою, інтенсивність інфікування різними паразитами у овець можуть бути посилені змішаним утриманням цих тварин разом із козами. З іншого боку, можливо, що змішане утримання також може впливати на різних паразитів у кіз. Специфічні дослідження для кожної інфекції в отарах овець і кіз мають розглядати змішане утримання як можливий фактор ризику, який слід включати в багатовимірний аналіз.